变性蛋白的免疫共沉淀方法详解

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当蛋白质处于正常天然构象时, 某些抗体所识别的表位未能暴露出来, 这种情况下需要采取下列方法进行变性蛋白的免疫沉淀。

所需溶液和试剂

注意：所有溶液均需要用 Milli-Q 超纯水或是相当纯度的其他水配制。

1. 变性细胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巯基乙醇 (β-ME)。β-ME 需新鲜加入，加入后先煮 10 分钟。

2. 细胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X- 100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4，1 μg /ml Leupeptin.

注意：使用之前加入 1 mM PMSF。

3. 蛋白 A 琼脂糖微球：取 1.5 g 蛋白 A 琼脂糖微球加入到 5 ml 的 1X PBS 中。4 °C 缓慢搅拌 2 小时。离心沉淀微球，用 PBS 清洗两次。将微球重悬在 1 倍体积的 PBS 中。（处理后的微球可以在 4 °C 存放 2 周）

4. 3X SDS 上样缓冲液：187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25 °C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v 溴酚蓝。

细胞裂解样品制备

1. 吸去培养基。加入含调控因子的新鲜培养基，处理所需的时间。

2. 在非变性条件下收集细胞，弃去培养基，用 PBS 清洗一次。

3. 弃去 PBS，每个板（150 x 25 mm）中加 0.4 ml 变性细胞裂解液（使用前预煮 10 分钟）。

4. 立即将所有细胞刮下，收集到 2.5 ml 的管中。

5. 沸水中煮 10 分钟。

6. 加入 4 倍体积（1.6 ml）冰冷的 1 X 细胞裂解液。所得即细胞裂解物。如有必要，样品裂解物可以保存在 –80 °C。

免疫沉淀

1. 将一抗加入到 200 μl 细胞裂解物中，在 4 °C 的转子上孵育过夜。

2. 加入 20 μl 50% 浆状的蛋白 A 琼脂糖微球。在 4 °C 的转子上孵育 1～3 个小时。

3. 4 °C 离心 30 秒。沉淀用 500 μl 细胞裂解液洗五次，洗完置于冰上。

4. 将沉淀用 20 μl 3X SDS 上样缓冲液重悬沉淀。涡旋震荡，离心 30 秒。

5. 把样品放在 95～100 °C 加热 2 - 5 分钟。

6. 取 15 - 30 μl 样品，上样到 SDS-PAGE 胶（12～15%）上。

7. Western 免疫印迹分析检测。