蛋白质纯化之离子交换法

一、仪器设备：

1.塑料管柱（Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm）

2.部分收集器（fraction collector, 另需准备干净试管约60 支）

3.浓缩用离心机（低速5,000 rpm）及浓缩离心管Centriplus

二、药品试剂：

1.DEAE Sephacel （胶体体积约15 mL，预先以缓冲液Buffer A-0 平衡好）

2.Buffer A-0

3.Buffer A-300 溶离液：Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

4.Buffer A-500 溶离液：Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

三、方法步骤：

1.将Econo-Pac 管柱架好，并将三向阀及软管等组合完成。

2.震荡DEAE Sephacel 胶体使其悬浮，小心倒入管柱中，让胶体慢慢沉降，在沉降过程中随时加入buffer A-0，勿使胶体干掉。

3.待胶体沉降完全后，高度应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直流洗，流速快慢可以不考虑；连接好收集器，每试管收2.5 mL。离子交换法的胶体平衡极为重要，可测流出液的pH 或离子浓度，看是否与buffer A-0 相同，若不一样则需要再流洗的。

4.样本的添加方法同上述胶体过滤法，并启动部分收集器开始收集，当样本全部没入胶体后，再加入同体积buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后，去除胶体上方的缓冲液，但勿使胶体干掉。

5.然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的，每批次流洗各50 mL，注意更换浓度时，胶体上方勿残存上一种溶液。

6.收集所有分划，进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定，结果作图。

7.收集GUS 活性区，并以Centriprep-30 浓缩至 _______ mL （IEX），记得要保留100 μL。

8.离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后，收起来交回。