免疫共沉淀技术
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。
但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
免疫沉淀反应（Immunoprecipitation）主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。
Immunoprecipitation
Co-immunoprecipitation
免疫共沉淀技术路线
准备工作：
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。
2. 加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/107个细胞、10 cm 培养皿或150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm 培养皿、75 cm2 培养瓶） 。
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5 ml EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上） 。
4. 4℃，14000 g 离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中 。
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 。
6. 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 。
7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子
8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 。
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 。
10. 加入一定体积的兔抗到500 μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 。
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育 。
12. 加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG） 。
13. 14000 rpm 瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS 。
14. 用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道） 。
15. 将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min 变性。
RIPA Buffer配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM 的储存液，室温保存）
EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100 mM 的储存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）
RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200 mM 的储存液，室温保存）
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制100 ml 的modified RIPA buffe：
1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。
2. 加10 ml 10%的NP-40 。
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 。
4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存 。
5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100 μl； PMSF， Na3VO4， NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
Tris-HCl： 50 mM， pH 7.4
NP-40： 1%
去氧胆酸钠：0.25%
NaCl： 150 mM
EDTA： 1 mM
PMSF： 1 mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂： 各1 μg/ml
Na3VO4： 1 mM
NaF： 1 mM
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