荧光淬灭法蛋白质定量实验方法与结果分析

蛋白组学研究是建立在蛋白定量 的基础上的，蛋白质快速定量主要原理是依据蛋白自身的发色基团或者和显色试剂间反应物的紫外吸收值来进行定量的，蛋白定量最常用的方法主要有BCA法、考马斯亮蓝法、以及lowry法，目前蛋白定量也有利用荧光法进行蛋白定量实验。

蛋白质含量通常采用氨基酸分析法、凯氏定氮法、比色法、紫外分光光度法等进行测定。蛋白质含量的荧光分析法是近年来发展起来的蛋白质含量分析方法，具有灵敏度高、线性范围宽等特点。采用荧光法测定蛋白质含量时通常选取含有表面活性剂的测定体系。

当溶液中含有表面活性剂时，荧光染料分子 之间通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体，多聚体的形成导致荧光强度降低。然后加入蛋白质溶液，导致多聚体解聚而使荧光强度增加。在一定蛋白质浓度范围内，荧光信号强度与蛋白质的浓度成正比。但是由于该反应历程复杂，不易推断反应机理，限制了该方法在计量学中的应用。

本文研究建立了一定浓度范围内蛋白质含量荧光淬灭测定方法，并且推断了该方法的反应历程和反应机理，有利于后续蛋白质标准物质定值权威方法的研究建立。

一、实验部分

1.仪器及试剂

超纯水(Milli Q超纯水系统纯化)，牛血清白蛋白(BSA)、异硫氰基荧光素(FITC)(美国Sigma-Aldrich公司)，漩涡混合器(德国IKA公司)，移液器(10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，法国Gilson公司)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，美国Fluka公司)、氯化钠(北京鼎国生物技术有限公司)、Tris、EDTA二钠盐(Invitrogen 公司)，分析天平UMX2(0.1g感量，瑞士Mettler Toledo公司)，TECAN M200酶标仪(瑞士TECAN公司)。

2.溶液配制

用超纯水配制CTAB缓冲溶液，其中含有CTAB20g/L、氯化钠1.4mol/L、Tris0.1mol/L和EDTA二钠盐20mmol/L，调节pH值至8.0。用上述CTAB缓冲溶液将FITC配制成1mg/mL的饱和溶液，取1μLFITC的饱和溶液加入10mLCTAB中稀释10000倍得到CTAB工作缓冲溶液。用纯水将BSA溶解配成10mg/mL的溶液，经过梯度稀释得到浓度为5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

3.测定方法

在酶标板每孔中加入50μL稀释后的FITC缓冲溶液，再分别加入50μL浓度为10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的BSA溶液，混合均匀后静置5min再进行测定，每个浓度水平平行分析3次取平均值。仪器参数设定如下:振荡30s，激发波长488nm，发射波长530nm，每孔取25次读数的平均值，积分时间20μs，测定温度37.0℃。

二、结果与讨论

1.蛋白质溶液浓度与荧光强度的关系

固定FITC的加入量为50μL，改变蛋白质溶液的加入量，考察荧光强度和蛋白质溶液浓度的关系。当各浓度蛋白质溶液的加入量均为1μL时，没有观察到蛋白质浓度与荧光信号强度之间的相关性。当蛋白质溶液的加入量增加到10μL和25μL时，随着蛋白质浓度的升高，FITC的荧光强度逐渐下降。但是，荧光强度的下降与蛋白质溶液浓度之间不呈线性关系。当蛋白质溶液加入量为25μL时，

由图2可见，当蛋白质加入量达到50μL时，随着蛋白质浓度的提高，FITC的荧光逐渐被淬灭，同时荧光强度的下降与蛋白质溶液的浓度呈线性关系，可用来测定蛋白质溶液的浓度，其线性范围为(0.1～10)mg/mLBSA。动态范围达到了两个数量级并涵盖了通常纯度标准物质定值研究的浓度范围，因此，该方法的深入研究有利于后续蛋白质标准物质权威定值方法的研究建立。

当蛋白质溶液的加入量进一步提高到100μL和200μL时，随着蛋白质浓度的提高，荧光强度仍然逐渐下降，但是荧光强度与蛋白质溶液浓度不再呈线性关系。

2.荧光淬灭机理的推测

其计量方法不同于传统的测量方法，需要对测定的过程和方法的机理进行详细的研究探讨。以计量学研究中的基准方法为例，基准方法是指一种具有最高计量学品质的方法，它的整个操作能够被描述和理解，它的不确定度能够被完全的评价并以SI单位表示。为了描述和理解上述整个实验过程，有必要对其荧光淬灭测定机理进行研究。

根据荧光强度随着蛋白质溶液浓度的增加而逐渐降低的现象，推测荧光淬灭很可能是通过与BSA的相互作用导致的。考虑FITC与BSA的作用平衡:

其中K为平衡常数。由质量作用定律可得:

(nFITC-BSA)=K(FITC)n(BSA) (1)

根据质量平衡可得:

c(FITC)=(FITC)+n(nFITC-BSA) (2)

c(BSA)=(BSA)+(nFITC-BSA) (3)

而荧光强度

Intensity=K(FITC) (4)

对式(1)、式(2)、式(3)和式(4)进行整理，可得:

c(BSA)=a/(FITC)n+b/(FITC)n-1+c(FITC)+d (5)

式中:a、b、c、d均为常数。

分别选取25μL、50μL和200μL的数据按照式(5)进行拟合。

由此可见，建立的模型可以很好地拟合出研究浓度范围内FITC与BSA的相互作用导致荧光淬灭的现象。另外根据拟合的结果，当BSA加入量分别为25μL、50μL和200μL时，拟合得到的系数n分别为0.28、0.17和0.33，这些系数都小于1，表明反应体系中1个荧光分子和3～5个BSA分子聚集在一起导致荧光淬灭。这可能是由于表面活性剂存在下蛋白质聚集成超分子结构时包裹了FITC，导致FITC荧光被淬灭，从而表现出随着蛋白质溶液浓度增加而出现荧光强度下降的现象。

三、结论

通过研究表面活性剂体系中荧光强度与溶液中蛋白质浓度的关系，发现在所研究的浓度范围内FITC的荧光强度随着蛋白质溶液浓度的增加而下降。根据蛋白质和FITC的作用模型进行数学推导与拟合后，发现提出的模型能够较好描述所研究范围内蛋白质浓度和荧光强度的关系。

在优化的实验条件下荧光强度的下降与蛋白质的浓度具有线性关系，线性相关系数达到0.993，BSA的线性范围为(0.1～10)mg/mL，覆盖了通常标准物质研制时的定值范围。良好表征的方法对于今后建立蛋白质标准物质定值权威方法具有积极的意义。

荧光淬灭法测定蛋白含量，主要依据是在一定蛋白浓度范围内，荧光信号的强度和蛋白质的浓度存在成正比的线性关系，因此需要提出比较好的蛋白质浓度和荧光信号强度的模型，也增加个蛋白定量的复杂性，也是其应用的一个局限性。