一种潜力无限的基因表达方法——甲醇酵母

蛋白表达技术全攻略

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你还在用E.col做基因表达 的研究吗?有点跟不上发展的脚步咯。新兴且发展迅速前途无限的甲醇酵母系统正越来越被人们熟知和看好。本文对这一新的基因表达系统的特点和科研进展做详细的介绍。

1 甲醇酵母表达系统的特点

1.1 宿主

七十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白(SCP),有很好的发酵基础,菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源,廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长,其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%[1]。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录 水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能,可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态,而在培养液中加入甲醇后,外源基因即被诱导表达。

巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器 ,其中大量合成过氧化物酶,因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中,可免受蛋白酶的降解,且不对细胞产生毒害。

1.2 载体

巴斯德毕赤酵母的载体是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。图1为一个典型的巴斯德毕赤酵母表达载体。该载体包含醇氧化酶—1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和3'AOX1),它们被多克隆位点(MCS)分开,外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时,它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上,外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

1.3 表达菌株的构建

与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似,构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：(1)经典遗传学操作方法(如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析);(2)分子遗传学方法(如DNA转化、基因置换等。[3])为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株,巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。对于图1所示的表达载体pPIC3,能以两种方式整合至染色体上。一种是在His4或5'AOX1 dNA片段的单酶切位点将质粒载体切成线性,通过单交换整合进染色体(图2A、B)。另一种用Bgl Ⅱ酶切此质粒载体,释放出包含AOX1末端序列的表达盒,与宿主染色体上的AOX1基因发生一步基因置换(图2C),这样得到的表达菌株为AOX1缺陷型,它们代谢甲醇的速度明显减慢,但有时表达外源蛋白的水平却比野生型菌株高得多,尤其表现在摇瓶培养β-半乳糖苷酶[3]、转化酶(invertase)[4]和乙肝病毒表面抗原上[5]。

与自主复制的质粒型表达载体不同,整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳[6]、免疫杂交[7]或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中[8],而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。

1.4 巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长

经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子,其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此,为了获得高产量的表达菌株,需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况,使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中,培养液的pH值无法控制,培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验,仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件,使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。

巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值,以降低蛋白酶的活性;最大的通气量;添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中,细胞迅速生长,菌体密度逐渐增大,但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时,甲醇被添加到培养液中,诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓,但产物表达旺盛。经研究人员的努力,多种生产外源蛋白的巴斯德毕赤酵母的分批和连续培养都有成功报道。

1.5 外源蛋白的分泌

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白,而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。当然,利用外源蛋白本身的信号序列很方便,因为基因的全部编码序列可以插入到表达载体的单个或多个克隆位点。但在许多例实验中,巴斯德毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌,如鼠表皮生长因子,产量达0。45g/L。

2 巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的表达

随着巴斯德毕赤酵母表达系统的不断发展和日趋完善,许多具有商业价值的外源蛋白在此系统中得到了成功表达。由于其表达载体上醇氧化酶基因强启动子的作用,外源蛋白的表达量很高,如破伤风毒素蛋白的产量达12g/L。外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分胞内表达和分泌到胞外两种方式。我们将在巴斯德毕赤酵母中表达外源蛋白的情况总结如表1。

国内在巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白方面的研究近年刚刚起步。国家海洋局第三海洋所的陈丹等人在此酵母中表达了鲈鱼生长激素,表达量为100mg/L。如今,美国Invitrogen公司已有该表达系统试剂盒出售,因此要利用此系统表达一个外源基因已十分方便。在国内外实验室的共同努力下,利用巴斯德毕赤酵母基因表达系统必将生产出更多具有商业价值的外源蛋白。

从上文的描述我们可以发现，甲醇酵母在基因表达的研究中具有明显的优势和应用前景，不过，具体的实验中有不少事项是需要的，例如信号肽失败的设计、PCR酶切设计，DNA聚合酶的使用等等，具体可见甲醇酵母表达实验的注意若干事项 。