总蛋白和膜蛋白提取方法

膜蛋白具有多种功能，在细胞识别、细胞信号转导、运输等有着中着重要的角色，因此也是极佳的药物靶点。抽提膜蛋白主要是进行蛋白组分析：常用的实验是非变性胶电泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。本文叙述了总蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。 一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法) 1. 自配裂解液(pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA , 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1 μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50 ml 裂解液/1 g湿菌体。 2. 将40 ml 菌液在12000 g，4 ℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1 ml裂解液悬浮菌体。 3. 超声粉碎，采用300 w，10 s超声/10 s间隔，超声20 min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4. 1000 g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

1. Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8 ℃下10000 g离心15 min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2. 用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1 ml Trizol加入0.3 ml无水乙醇混匀，室温放置3 min，2-8 ℃不超过2000 g离心5 min。

3. 将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1 ml Trizol加入1.5 ml异丙醇，室温放置10 min，2-8 ℃下12000 g离心10 min，弃上清。

4. 用含有0.3 M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1 ml Trizol加入2 ml洗液，室温放置20 min， 2-8 ℃下7500 g离心5 min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2 ml无水乙醇，涡旋后室温放置20 min，2-8 ℃下7500 g离心5 min，弃上清。

5. 冷冻干燥5-10 min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50 ℃温浴使其完全溶解，2-8 ℃下10000 g离心10 min去除不溶物。

6. 替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8 ℃的1% SDS溶液中透析3次，1000 g离心10 min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。

三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)

1. 配制疏水性蛋白提取液(非裂解液)：1% Triton X-114，150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，调pH值至8.0备用。

2. 菌液于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体。

3. 菌体沉淀加入1 ml冷提取液，于4 ℃条件下放置2 h，17000 g离心10 min，去除沉淀取上清。

4. 将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37 ℃条件下放置10 min使其分层。室温下1000 g离心10 min使液相和去污相充分分层。

5. 将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45 min。

6. 于4 ℃条件下17000 g离心30 min，用去离子水洗涤沉淀3次。

7. 将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。

8. SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。

注意事项：膜蛋白的含量比较少，需要收集比较多的细胞，最好是用试剂盒提取膜蛋白如：南京凯基的是试剂盒、Thermo膜蛋白提取试剂盒、碧云天膜蛋白提取试剂。