双向电泳操作步骤

水化上样( 被动上样)

1. 从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。

2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3. 用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。

4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收； 还使胶条下面的溶液产生气泡。如产 生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

5. 放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条 约 3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。

6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化 11~15h。

第一向 等电聚焦

1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH2O 5~8μl 润湿。

2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿 的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

3. 将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正 极，确保胶条与电极紧密接触。

4. 在每根胶条上覆盖 2- 3ml 矿物油。

5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样 品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条， 室温放置10 分钟，使其溶解。

第二向 SDS-PAGE电泳

1. 配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2. 待凝胶凝固后， 倒去分离胶表面的MilliQ水、 乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。

3. 配制胶条平衡缓冲液 I

4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(17cmIPG)平衡缓冲液 I ，在水平摇床 上缓慢摇晃 15 分钟。

6. 配制胶条平衡缓冲液 II 。

7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓 冲液 II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

8. 用滤纸吸去 SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上， 凝胶的顶部面对自己。

9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。

11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸 上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面） 。

12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中漂洗数次。

13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接 触。注意：不要在胶条下方产生气泡， 应推动凝胶背面的支撑膜， 不要碰到面胶。

15. 放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为 15℃。

17. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流（5mA~10mA/gel/17cm） ，待样品在完全走出IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流 （20-30mA/gel/17cm） 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防 止污染胶面） 。

19. 进行染色。