种子蛋白质系统分析：种子蛋白质组分分析

一、目的 种子蛋白质由10％-15％的原生质蛋白质（复合蛋白质）和85％-90%的贮藏蛋白质（简单蛋白质）组成。Osbome 在种子中发现与分离出来清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白等4 个组分。不同作物种子中各蛋白组分比例有很大差异，不同蛋白组分的必需氨基酸含量也不相同，通常醇溶蛋白中缺乏Lys、Trp、Met 及Ile 等必需氨基酸，其营养价值最低。因此，根据种子蛋白质组分的相对含量，可以评判蛋白质的品质。通过本实验学习并掌握用连续累进提取法分离种子蛋白质各组分。 二、原理 根据清蛋白可溶于水、球蛋白溶于稀盐溶液、醇溶蛋白溶于乙醇、谷蛋白可溶于稀碱或稀酸溶液的性质，可用不同溶剂把这4 种组分从样品中分离提取出来。然后用凯氏法分别定量或利用SDS-PAGE 进行各组分亚基分析。 三、 仪器 、试剂和材料 1． 仪器 ( 1）日本MRK 公司产VS - KT-P 自动定氮仪 ( 2）样品磨 ( 3）玻璃层析柱 2． 试剂 ( 1 ) 50％异丙醇（V / V）或70％乙醇 ( 2 ) 3％硼酸 ( 3 )0.5mol / L NaCI ( 4 )0.l mol / L NaOH 四、操作步骤 1．制样 谷物籽粒风干，用样品磨粉碎，放干燥器中备用。 2．装柱 在玻璃层析柱底部过滤筛板上置一层滤纸。称取酸洗并经540℃ 高温处理的石英砂 60g，样品2g 装入三角瓶中混匀，每个样品重复3 次，设空白对照。另称取石英砂20g，其中10g 置于层析柱底部，将三角瓶中混合物装入柱内，再将剩余的10g 石英砂加入层析柱上部。装好后用小木棒轻轻敲打把空气排出。 3．提取 在提取前加20rnl 蒸馏 水，排出柱内气体，浸湿样品，然后按下列步骤进行。 ( 1）加100ml 蒸馏 水调节流速为0.5ml / min，提取清蛋白，定容于100ml 容量瓶中。 ( 2）加100ml0.5mol / L NaCI 提取球蛋白，定容于100 ml 容量瓶中。 ( 3）加100ml 70％乙醇提取醇溶蛋白，定容于100ml 容量瓶中。 ( 4）加100ml0.1 mol / L NaOH 提取谷蛋白，定容于100ml 容量瓶中。 4．提取液中蛋白质含量测定 ( 1）从每一容量瓶中吸取10ml 提取液放入消化管中（摇匀后再吸）。然后加3ml 浓浓硫酸，2.5g 催化剂。用150℃ 加热0.5h 蒸干溶剂，然后用200℃消化0.5h , 400℃ 消 化0.5h。 ( 2）消化管自然冷却后，即可用自动定氮仪进行含氮量测定。 5．样品 总蛋白 质含量测定 每一样品称取0.2g ，重复3 次，然后按本实验I 方法用自动定氮仪测定含氮量。 五、结果处理 ( l）计算样品中蛋白质含量。 ( 2）计算各蛋白组分在样品中的含量及占 总蛋白 质的比率。