植物基因在大肠杆菌中的原核表达

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。

当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。

以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。

1.准备工作（试剂配置和器材准备）

1)操作流程示意图

主要步骤操作

①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收

②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收

③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化

④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株

⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白

⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签

2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。

3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。

4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。

2.操作步骤

[1] 制备载体

1）载体消化和胶纯化

3μg pET载体

3μl 10×限制性内切酶buffer

10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%）

3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要

补足水到30μl

2)37℃温浴2-4h

3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度

4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min

5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。

6)-20℃保存备用。

[2]制备插入片段

限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。