Western bloting 技术

一、实验目的与原理 Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合抗体。在加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白―一抗―二抗的位置即将呈现一定的颜色。 二、材料与方法 1.材料 从微生物细胞中提取的多酚氧化酶（PPO）：10μl，20μl NC膜：硝酸纤维素膜 2.仪器： 电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床 3.试剂： 转移缓冲液：48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同时加入20%乙醇。 封闭液与稀释液：PBS（牛血清白蛋白） 辣根过氧化物酶显色液：现配现用 三、操作步骤 1.SDS-PAGE电泳见上个实验 2.电转 ⑴剪NC膜大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。 ⑵在转移装置中依次将三层滤纸、凝胶、滤纸、三层滤纸放在一起。 ⑶将装好的转移装置放入电转移槽中NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。 ⑷接通电源电压63V，电流90mA,转移过夜。 ⑸转移结束后，取出装置，依次取掉各层，用铅笔在膜的上沿做标记，切下其中一个孔所对应膜的一半。 ⑹NC膜的封闭：将NC膜放入一塑料袋中，加入封闭液3ml，封口，轻轻震荡2h。 ⑺将封闭好的NC膜放入另一塑料袋中，加入用封闭液稀释的一抗，2.8ml，封口。4℃下轻摇2h。 ⑻洗膜：弃去反应液，用一抗稀释液洗三次，每次10min。 将膜从PBS中取出转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min。 ⑼将二抗用二抗稀释液稀释，将NC膜放入塑料袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，轻轻震荡1h。 ⑽洗膜：取出膜转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min，三次。 ⑾将膜放入显色液中，室温轻轻摇动，10min。 ⑿待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察记录。