使用ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统

使用 ProteOn XPR36 蛋白相互作用阵列系统

分析抗体 - 膜结合蛋白以及蛋白 - 脂类物质间的相互作用

介绍：

研究细胞膜、膜结合蛋白和抗体间的相互作用以及这些作用的互相影响是药物研发中非常值得关注的事情。膜蛋白和膜相关蛋白以及多肽类物质在很多生物过程中的地位都非常重要，同时还参与到一些诸如癌症等疾病的关键信号通路中。因此，膜蛋白正迅速成为下一代药物靶点分子大类。

ProteOn XPR36 蛋白相互作用阵列系统基于表面等离子体共振（ SPR ）技术，可同步测定 36 种生物分子间的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和两种重要的多肽。 Amyloid beta （ A ）肽在阿尔茨海默病的病理改变中起重要作用，而 -synuclein 肽则存在于帕金森病的病理变化中。通过一张修饰过的 ProteOn 传感芯片，我们将 Ab 与人工膜的结合动力学数据给测定出来。我们还描述了如何使用 ProteOn NLC 芯片来捕获生物素标记的和非生物素标记的膜蛋白脂质体，并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗体的，呈明显剂量 - 效应关系的相互作用曲线。

图 1. ProteOn XPR36 系统配基 - 分析物结合分析的 6 × 6 阵列格式。 A) 6 个 ligand 被偶联到 6 条平行的纵向通道中（蓝色）； B) 6 个 analyte 注入到 6 条与之前相垂直的通道中（黄色）； C) 单个 ligand�analyte 互作位点 ( 绿色区域 ) 以及 2 个位点间参照（黄色）。

实验 1. 使用单层小泡（ SUVs ）对 GLM 芯片进行修饰并捕获 A 和 -Synuclein 多肽

芯片修饰

传感芯片表面用 50 mM NaOH 和 8 mM CHAPS 分别在横向和纵向两个方向冲洗两遍，然后纵向连续注入 3 针 PBS ，流速设为 100 µl/min 。通道 1 、 3 和 5 用 0.05 M sulfo-NHS 和 0.02 M EDAC 活化，条件为 30 µl/min ， 6 分钟。将 5 µl Undecylamine （十一胺）和 495 l DMSO （二甲基亚砜）混合后用 pH 5.0 的醋酸钠溶液稀释 20 倍。混合液用移液器吹打混匀，直至澄清。 Undecylamine (0.05% v/v) 以 30µl/min ，注入到通道 1 、 3 和 5 ，持续 6 分钟。最后将通道 1 、 3 和 5 用 1M 盐酸乙醇胺去活化，条件是 30 µl/min ， 6 分钟。随后芯片表面用 50 mM NaOH 纵向流过芯片以稳定基线。

脂质捕获

单层小泡（ SUV ）的制备是参照前人文献 (Smith et al., 2008) ，然后用 PBS 稀释到终浓度 0.4 mM 。 SUV 在 30 µl/min 的流速下纵向注入芯片 400s 。 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml) 注入通道 1 和 2 。 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS) 注入通道 3 和 4 。通道 5 和 6 流过 POPC 和 POPS 的混合物。

Analyte 注入

A 蛋白 (100 µg) 按照已有文献的描述的制备成终浓度 22 µM 的 PBS 溶液。芯片表面用 PBS 以 100 µl/min 横向注入 30 秒冲洗。冲洗 3-4 次后 A (8.8 µM) 或 -synuclein (7 µM) 以 100 µl/min 横向注入，结合 1 分钟，解离 10 分钟。测定动力学数据时， A 蛋白以一系列浓度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入 4 个通道，仅留一个通道注入缓冲液。

芯片表面再生

芯片再生需要去掉脂质，用 50 mM NaOH 和 8mM CHAPS 依次注入芯片，采用短时脉冲形式，即 100 µl/min 的流速， 18 秒。

图 2. 将特定的脂质 POPC, POPS, 和 POPC/POPS 捕获在 Undecylamine 处理过的 GLM 传感芯片表面。

图 3. A 蛋白有选择性地结合到用 Undecylamine 处理过，并偶联了脂质 POPC, POPS, or POPC/POPS 的通道中； A 蛋白不会被捕获到未经处理的芯片表面。

图 4. -synuclein 蛋白有选择性地结合到用 Undecylamine 处理过，并偶联了脂质 POPC, POPS, or POPC/POPS 的通道中； -synuclein 不会被捕获到未经处理的芯片表面。

图 5. A 蛋白和 OPC/POPS 处理过的表面的浓度依赖性结合曲线。 动力学数据来自 3 次结合实验的平均值： ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M -1 s-1 ; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1 ; KD = 407 (± 9) nM 。

图 6. 芯片再生后，将脂质 POPC, POPS, 和 POPC/POPS 再次捕到 undecylamine 处理过的 GLM 传感芯片上。 通道 1 ， 3 和 5 的再生用 50 mM NaOH 和 8mM CHAPS 依次注入。实线代表第一次脂质捕获曲线，虚线表示第二次捕获。点线代表脂质注入到未处理过的芯片通道 2 ， 4 和 6 。

实验 2. 生物素修饰的脂质体捕获到 NLC 芯片表面             

脂质结合

将含单纯疱疹病毒标签的 M2 肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰（ DMPC ）胆碱脂质体（以色列 Weizmann 研究所 Shai Arkin 教授惠赠）用缓冲液（ PBS ）稀释 2 倍，然后以 25 l/min 流速注入垂直方向的 1 通道，注入 2 次，共 60 l 。作为对照，将不含 HSV-M2 肽的生物素化的脂质体和非生物素化的脂质体分别注入水平方向的 2 和 3 通道。

Analyte 注入

将 120l 333nM 的抗 HSV 抗体以 100l /min 流速注入水平通道。

再生

以 100 l /min 流速注入 20mM CHAPS ，注入 1.2 分钟去除脂质体和抗体。后续分析实验可重新偶联脂质体和抗体。

图 7. 生物素化脂质体捕获到 NLC 芯片表面。 通道 1 （蓝色曲线），整合 HSV-M2 肽的生物素化脂质体；通道 2 （粉色曲线），不含 HSV-M2 肽的非生物素化脂质体（无结合）；通道 3 （浅蓝色曲线），不含 HSV-M2 肽的生物素化脂质体（无结合）。

图 8 捕获到 NLC 芯片表面的含 HSV-M2 肽的生物素化脂质体与抗 HSV 抗体的相互作用。 左图，通道中抗 HSV 抗体与脂质体结合的原始图线。通道 1 （蓝色曲线），整合 HSV-M2 肽的生物素化脂质体；通道 2 （粉色曲线），不含 HSV-M2 肽的非生物素化脂质体（无结合）；通道 3 （浅蓝色曲线），不含 HSV-M2 肽的生物素化脂质体（无结合）。右图，抗 HSV 抗体与整合 HSV-M2 肽的生物素化脂质体的特异性反应（以通道 2 为参照通道）。

图 9. 脂质体再生和重新捕获。

实验 3. 在修饰过的 NLC 芯片表面捕获 非生物素化的脂质体

脂质的结合

为了避免使用囊泡，将生物素化的双棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE) 加入到含有 10% DMSO 的运行缓冲液中， 在垂直方向上以 25 l/min 的流速注射 180 l 到通道 1 和通道 2 ，将含有 HSV- M2 多肽的非生物素化的脂质体以 25 l/min 的流速注射 100 l 到通道 1 ，通道 2 作为空白参照。

Analyte 的注入

抗 HSV 的抗体分别以 10, 5, 和 2.5 nM 三个浓度， 100 μl/min 的流速，水平注射 250μl 。

再生

将 20 mM Tween 20 或 20 mM CHAPS 以 25 μl/min 的流速注射 30 μl 可以除去脂质体和抗体。再生后，按照上述方法重复注射过程，可将脂质体重新捕获到 NLC 芯片表面。

图 10.  抗 HSV 的抗体 (10, 5, 和 2.5 nM) 与嵌入到 NLC 芯片表面脂质体中的 HSV-M2 多肽的相互作用。

结论

•    ProteOn XPR36 蛋白相互作用系统提供了操作简便、低成本的方法，便于研究膜 - 蛋白之间和膜蛋白 - 抗体之间的相互作用。

•    这些相互作用能通过 ProteOn 系统的 6*6 阵列采用高通量的方式进行测定。

•    源于 POPC 和 POPS 的单层小泡（ SUV ）能够被反复地捕获到修饰过的 ProteOn GLC 芯片上， Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的结合程度亦能测定。

•    能测定 Aβ 多肽与芯片上捕获的 POPC/POPS SUV 表面的结合动力学。