蛋白质PEG化修饰与纯化

聚乙二醇具有较广的分子量分布，随着平均分子量的不同，性质也产生差异，当分子量小于1000Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是蜡状白色固体，固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。毒性随分子量的增加而减少，小于400Da的 PEG在体内会经乙醇脱氢酶降解成有毒的代谢物，而分子量大于1000 Da的PEG经过多年应用于食品业、化妆品业和制药业证明没有毒性。 聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，因而具有良好的水溶性，同时又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部分有机溶剂。大多数蛋白质经聚乙二醇修饰后，除保留或增加其水溶性外，还可以获得在一些有机溶剂中的溶解性。在蛋白质溶液中，聚乙二醇无论是处于游离还是结合形式，即使浓度很高，对蛋白质分子都没有副作用。聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。 聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生。 在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>氨基>氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基，包括氨基或氨基。 聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（PEGylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。