DNA 酶 I 足迹分析法实验-用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数

材料与仪器

含有DNA结合位点的质粒DNA
适当的限制性内切核酸酶 100%乙醇及冰冷的70%乙醇 TE缓冲液 [α-32P] dNTP (3000〜6000 Ci mmol)水溶液 1O× Klenow片段缓冲液 E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段 5 mmol L 4dNTP 混合液 脱氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5) 分析缓冲液A或B 干冰 DNA酶I终止缓冲液 DNA酶I储存缓冲液 甲酰胺加样缓冲液
10 mL 一次性塑料管 硅烷化1.5 mL微量离心管 可调节水浴锅（±0. 1℃) 12 in×7.5 in大小的玻璃或不锈钢碟 有盖子的塑料微量离心管 6 mm宽间隔12 mm的DNA测序胶梳 平头Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm胶）

步骤

1) 用胶片扫描装置构建一个该胶片的二维数字图像。

2) 对每个结合位点的被保护DNA区带，在每条泳道 上（也就是各配体的每一浓度）的光密度进行积分。

最好是将连续的条带群作为单独一组（即图中的方块）来分析。只要所有被包括在内的条带均匀地出现，这种简化是合适的。在所有的泳道上密度最大而且密度较相似的条带之间的最低密度处（也就是高度保护区）画出边界以选定各方块的两端。很关键的是，胶片的每泳道中各方块内都含有完全相同的条带。

3) 为胶片局部背景光吸收而校正各泳道中的各方块的光密度积分值。可用图像分析软件进行如下计算：

a. 在各方块所在位置上，选定各泳道之间空白处的中心，定义小长方形

b. 计算各小长方形中的像素光密度值的直方图，将概率最高的像素光密度值定义为局部背景。

c. 对于每方块和每泳道，分别算出泳道每侧的平均背景值。

d. 将该平均值乘以方块中的像素数目。

e. 从光密度积分值中减去所得值即得到该方块中的光密度积分校正值。

4) 将各组结合位点的校正光密度积分值对该泳道中的总DNA值进行标准化。

a. 选择1个或多个方块，除去滴定点及非常高敏感的区带，来代表泳道中的DNA总浓度。

b. 按步骤2及步骤3测定这些标准块的光密度积分校正值。

c. 计算每组结合位点的光密度比值（Dsite/Dstd)。如果选择不止一个标准组（方块），则将其和作为Dstd。

选择两个大标准块较为实际，也足够了。其中一个靠近电泳起始处而远离结合位点， 另一个则在离起点更远处。仔细检查每个标准块内配体浓度依赖性的系统误差，这种误差可导致标准无效。

5)将OD比值按以下公式换算成保护分数值（f):

f= 1-( Dn, site/Dn,std)/ ( Dr, Site / Dr, std )

式中，n为确定蛋向质配体浓度的任一电泳道；r为参考泳道（每个实验都必须设置）， 其中在反应混合物中不加蛋白质配体。用各组结合位点的/值对蛋白质配体浓度制作结合曲线。

如果按所述的方案做，而对照实验（Brenowitz et al.，1986a,b)显示DNA酶I的作用对蛋白质-DNA结合平衡常数无影响，f值就达到了饱和分数值（F)。能观测到的f值往往不能覆盖全程（0〜1)。其原因之一是无法在加DNA酶I之前计算DNA的切口 (也就是，即便在饱和配体浓度时，Dn,siK>0。因此，在分析数据时，最好将f值定义为与结合曲线成正比的转换曲线，将两条曲线的极限值U和f分别为上限值和下限值）作为可调节参数。

对于单结合位点或相互之间无协同作用的多结合位点，其结合曲线为Langmuir等温线.