醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白

实验原理

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。它具有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清 蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析检测，是医学和临床检验的常规技术。

本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清 蛋白。血清中含有白蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸 组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中白蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1－、α2－、β－及γ－球蛋白。这些区带经洗脱后可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。

试剂和器材

一、试剂

巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.07）：巴比妥1.66 g，巴比妥钠12.76 g，加水至1000 ml。

置4℃冰箱保存，备用。

染色液：氨基黑10B 0.5 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸馏 水40 ml，混匀。

漂洗液：含95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸馏 水50 ml，混匀。

透明液：冰醋酸25 ml，无水乙醇75 ml，混匀。

二、材料

新鲜血清（未溶血）

三、器材

醋酸纤维薄膜（2×8 cm），培养皿，点样器，电泳仪 ，玻璃板，粗滤纸 ，铅笔和直尺，竹镊子

四、操作方法

1. 浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别光泽面和无光泽面，并在角上用笔做上记号），小心平放在盛有缓冲液的平皿中，浸泡30min左右。

2. 点样：将浸透的薄膜从缓冲液取出，夹在两层粗滤纸 内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），使其底边与模板底边对齐。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，再将点样器轻轻地印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。点样区距阴极端1.5 cm处。 3. 电泳：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥。将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。通电，调节电流强度0.4－0.6mA/cm膜宽度，电泳时间约1~1.5小时。 4. 染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡10 min。

5. 漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机将薄膜吹干。

6. 透明：将脱色吹干后的薄膜浸入透明液中，浸泡2~3分钟后，取出紧贴于洁净玻璃板上，两者间不能有气泡，干后即为透明的薄膜图谱。 注意事项

（1）市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15~30 s 内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。

（2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05~0.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。

（3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。

（4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。

（5）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4~0.6 mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。