神经组织块膜片钳全细胞记录实验

原理

通过全细胞膜片技术来检测神经元兴奋性及其放电活动，是电生理实验的基本方法。神经组织块膜片钳技术相对于培养细胞膜片钳技术而言，细胞更接近原始的生理环境，细胞具有更好的生理状态，封接后可维持更长的时间。

材料与仪器

步骤

1.大鼠以0.5ml/100g1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部去毛备皮，颈椎脱臼法处死。

2.迅速剪开其背部皮肤，自L5、L3处横断脊椎，剪开肌肉，迅速取下L5-3脊椎，并置于冰水混合状态的氧饱和ACSF中，以上过程要求迅速，在1min之内完成，以保证神经元活性。3.仔细去除脊椎周围肌肉组织。

4将脊椎沿矢状面纵向剖开，将其一分为二，用游丝摄剥离脊髓，如果采用单侧疼痛模型，如CCD、CCI、SNL等，需分清左右侧背根神经节(DRG),其区分办法为脊髓沿正中矢状面剖开后其椎管直径头端大千尾端。

5沿脊椎连接处轻轻拼开，便可见到在椎板下面的背根神经节，仔细分离周围硬脊膜，用游丝摄轻轻夹住背根神经节轴突束深部，将其轻轻提起，摘取L5、L3背根神经节，置于氧饱和的室温ACSF的35mm培养皿中（注意本步骤要求实验者动作轻柔，切忌用游丝摄直接夹取神经节，对其造成损伤）。

6在体视显微镜下，仔细剥除DRG周围结缔组织及被膜。

7.将组织块及消化酶浓缩液（见前述）放入离心管中，用氧饱和的ACSF稀释至2ml,于37℃恒温水浴中孵育45min。

8取出组织块，放入氧饱和室温ACSF中，静置1-2h后开始实验。

9.消化后细胞在40X物镜下如图3-4。

10.以上步骤可用于其他组织的制备，关键点在于保证目的细胞的活性及尽量清除附着于细胞表面的黏连蛋白、细胞碎片等杂质，消化液的配制及消化时间可根据不同的标本进行调整。

11．选用1.4mm的硬质玻璃微管（国产毛还玻璃微管需用乙醇浸泡，超纯水清洗并且超声微波震荡，以去除油脂和灰尘，烘干备用）。

12用乙醇灯将玻璃微管两端轻微烧制，使其棱角变得圆钝。

13.在P-97拉制仪上用三步法拉制出尖端直径为1µm左右的玻璃微电极（检验方法为灌入电极内液后入水电阻为5-8MΩ)。

14.电极在实验前拉制，不可过夜。

15充灌电极内液，内含玻璃毛细管的电极可用带有合适直径针管的注射器从尾部充灌。

16酶消化后的DRG置于循环灌流的氧饱和ACSF记录槽中，用有尼龙网网格的"U"形铅金丝固定，使标本完全浸于ACSF中，并保证一定的灌流速度使神经元能够充分补给，并将液流调整平稳后，开始封接等操作。

17实验用Olympus正置显微镜，用40X浸水物镜观察单个DRG神经元形态并进行可视封接。在高倍镜下找到细胞(Camera处拉杆处于拉出状态，镜头拉杆处千推入状态），逐渐涸亮视野，则可见清晰的细胞图像。红外可视条件下，选择表面光滑、轮廓清楚、外观柔和、有弹性的细胞进行封接，电极尖端接触细胞表面容易形成凹陷。而状态较差的神经元则表面皱缩或肿胀、轮廓模糊不清、可见到细胞核。

18.将充灌好细胞内液的玻璃微电极安装于电极夹持器上，并用螺帽固定（注意用于固定玻璃微电极的橡皮环必须与之紧密结合，不能产生漏气，否则将影响封接）。

19.通过与电极夹持器相连的硅胶管给予电极尖端适当正压充灌，防止玻璃微电极尖端污染。

20.通过微操作系统将玻璃微电极尖端下降至灌流液面以下。此时采用pClamp软件的sealtest可测量玻璃微电极电阻，保证其在5-8Ω。

21电极刚入水时测试波形基线不在零位置上，必须将基线补偿回零。在Multiclamp700B界面上采用Auto按钮，如为Muiticlamp200B则需用手动调节。

22低倍物镜下找到电极并将其置于视野中心或略偏左侧。

23.将高倍镜入水，使之处于最低状态，逐渐将高倍镜上抬找到电极尖端，中倍Manipulation速度下降至可见细胞轮廓，将Manipulation转为慢速，将电极尖端位置与细胞相对位置调整好，慢速接触，当电极尖端与细胞膜接触时，sealtest指示Rm会有所上升，将电极进一步下压，Rm会进一步上升。

24通过与电极夹持器相连的塑胶管向电极内稍加负压，当细胞状态良好时，Rm值会迅速上升，直至形成高阻封接(GΩ封接）。

25电极电容补偿，使用Multiclamp700B放大器时，直接依次点击快慢电容补偿的Auto按钮即可（图3-5)。

26采用更大的负压吸引，打破细胞膜，使电极内与细胞内贯通，成为全细胞膜片钳记录模式。此步骤容易造成封接的不稳定，需格外小心。对于初学者来说需要一个摸索过程，可采用嘴吸的方法，一般采用脉冲式负压吸引，效果较好。一些放大器提供了"Zap"点击破膜功能。

27串联电阻补偿。勾选"Wholecell",勾选"RsCompensation",将"RsCompensation"下的"correction"及"Prediction"上升至70%以上，同时逐渐调整''Wholecell"下的电容及电阻值，使之达到要求，见结果判读部分（图3-6)。

28.通过Clampex软件设置的参数对神经元进行电生理实验。破膜形成全细胞记录模式后，可在Multiclamp700B软件界面上读出I1,.k值，又值，在Clampex软件中使用Membranetest可测最Cm、Rm、Ra值，确保18,.k<200pA,Vm<-50mV,Ra<20mfl,rm>SOMO。Rm最好为Ra的10倍以上，否则需要进行串联电阻补偿。图3-8为应用Clampex记录到的典型电流钳记录，图3-9为应用Clampex记录得到的典型电压钳记录。

注意事项

1.取材过程中要保证神经元随时处于氧饱和ACSF中或者处千有血流灌注的状态下。

2.细胞内液及细胞外液的pH值和渗透压值要符合生理状态。

3.对细胞进行钳制时，要选择表面光滑的方位。

常见问题

1制备电极内液时要保证整个过程温度在O℃左右，并且内液要用滤膜过滤3次以上，以保证内液中无杂质。

2.实验过程中撕膜的程度决定了实验的成败，撕除背根神经节外膜后（硬脊膜），应注意其还有一层膜（蛛网膜及软脊膜），应尽量将其去除，取出后神经节神经元有略蓬松感。撕膜时动作轻柔．注意勿损伤神经元。