视神经损伤模型实验-荧光金逆行性标记（上丘及外侧膝状体）

在上丘和外侧膝状体进行荧光金逆行性标记存活的节细胞。这种方法常结合视神经夹伤模型使用。上丘逆行性标记可分为两种，损伤前标记及损伤后标记。损伤前标记用于研究存活的节细胞，一般在损伤前3d进行标记。损伤后标记一般用于研究存活的纤维及再生纤维，一般在处死前3d进行标记。

材料与仪器

实验动物
1%戊巴比妥钠 荧光金
手术显微镜 显微手术器械

步骤

(1)戊巴比妥钠(50mg/kg体重）腹腔内注射深度麻醉动物。

(2)用颅内手术专用固定器将大鼠头部固定。

(3)自颅顶正中线垂直切开头皮，长约3-4cm,使用双氧水擦拭头皮，暴露矢状缝和人字缝。

(4)找到Bregma点，确定双侧上丘（以Bregma点为零点，后移6.8mm,旁开1.6mm)和外侧膝状体（以Bregma点为零点，后移4.6mm和旁开3.8mm)在颅骨表面投影，造成4个直径约1mm的骨孔，上丘深4mm,外侧膝状体深5.6mm。

(5)用牙钻钻开骨孔。

(6)剪开脑膜，用负压吸引器吸取大脑皮层，暴露双侧上丘和顶盖前区及外侧膝状体。

(7)使用微玻管戳穿脑膜。

(8)将一小块浸有5%荧光金的明胶海绵放置于脑表面。

(9)依次缝合各层组织，做抗感染处理。

5视网膜铺片及节细胞计数

(1)千术后相应时间点用戊巴比妥钠过量麻醉处死动物。

(2)在眼球上做好方向的标记。

(3)立即取出眼球浸入4%多聚甲醛溶液中，沿角巩膜缘剪除角膜，去除晶状体和玻璃体。

(4)利用标记的方向分离视网膜并做4个切口，将视网膜分成相等的颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限。

(5)在4%多聚甲醛中固定40min后，用PBS(0.1mol/L,pH7.4)漂洗3次，每次5min。

(6)用小毛笔刷将视网膜平铺于载玻片，以50%甘油PBS封片（荧光金在紫外线激发下容易淬灭，加入抗荧光衰减封片剂封片更好）。

(7)在OlympusBX5l荧光显微镜下，以物镜20倍的栅格框(0.5cmx0.5mm)界定样本区。

(8)沿每一象限中线，距视盘边缘1、2、3mm各处各选一个样本区，在紫外激发模式下，计数每一样本区内荧光金标记存活的节细胞（图4-11)。