由酶循环确定烟酰胺核苷酸实验-​NAD（H）的测定

谷氨酸脱氢酶生成的 NAD＋ 在 LDH 催化下转化为 NADH，在第二步反应中形成的丙酮酸的测定可以通过 LDH 反应中添加 NADH。

过量的 NADH 通过碱处理破坏。

材料与仪器

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

0.1 ml 循环混合物

被测定的 x ul NAD 或 NADPH 溶液［x 为 1～20； 浓度为（3～50）×10-9 mol/L］。

（20～x）ul 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

37℃ 培养 30 min

将样品转移到 100℃、2 min 来终止反应，接着将样品转移至冰浴

每个样品中加入 0.1 ml 溶液 II，25℃ 孵育 15 min，接着将样品转移至冰浴，加入 25 ul 5 mol/L HCl

0.1 ml 的样品液中加入 0.2 ml 9 mol/L NaOH

60℃ 孵育 10 min， 然后加入 1 ml 水，测定荧光强度。

常见问题

试剂：

0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.4

0.1 mol/L α-酮戊二酸（二钠盐，Mr＝190.1；190 mg 溶于 10 ml 水中）

1 mol/L 乳酸盐（钠盐，Mr＝112.1；1.1 g 溶于 10 ml水中）

0.01 mol/L ADP（二钠盐，Mr＝471.2；47.1 mg 溶于 10 ml水中）

1.0 mol/L 乙酸铵（Mr＝77.1；771 mg 溶于10 ml 水中）

谷氨酸脱氢酶（来自于牛肝脏，40 U/mg，配制溶液：40 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

D-乳酸脱氢酶（来自于猪心脏，约 550 U/mg，10 mg/ml， 配制溶液：55 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

9 mol/L NaOH（36 g 溶于 100 ml水中）

0.01 mol/L NADH（71 mg 溶于 10 ml水中）

磷酸钠缓冲液

8.97 g NaH2PO4（单水，Mr＝138）

2.61 g K2HPO4（Mr＝174.2）

溶于100 ml水中

溶液Ⅰ（循环混合物）

溶液Ⅱ

加入新鲜配置的 1 ml 磷酸钠缓冲液中；

20 ul 10 mmol/L NADH

储藏溶液 LDH 1.5 ug（稀释储藏溶液 100 倍，取 15 ul）