蛋白酶的测定实验-茚三酮测定法
原理
茚三酮反应是一种灵敏度高的蛋白实验。游离的氨基酸可以被高敏感性检测出来。这个方法可以被用来继续蛋白质的酶降解。上述的酪蛋白降解在这个实验系统中用作蛋白酶反应。未水解的蛋白质被三氯乙酸沉淀下来,而茚三酮反应发生在上清液。
材料与仪器
蛋白酶溶液Tris-HCl NaOH 乙酸 三氯乙酸 酪蛋白底物 乙酸缓冲液 KCN 乙醇 标准 BSA 溶液 亮氨酸
水浴锅 分光光度计
步骤
1. 酪蛋白降解
0.4 ml 酪蛋白底物恢复到 35℃,0.2 ml 蛋白酶溶液溶于 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0,加入 10 mmol/L CaCl2。35℃ 培养混合物,10 min 后加入 1 ml 1.2mol/L TCA 停止反应。用同样的方法处理空白对照,不同点是加入 TCA 后,向酪蛋白底物中加入蛋白酶溶液。离心样品 5 min。
2. 萌三酮反应
0.2 ml TCA 上清液
0.1 ml 0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液
0.1 ml 茚三酮试剂
在水浴中放置 10 min 或者加热箱中加热到 100℃,而后在冰中冷却 1 min,再加入 0.5 ml 50% 乙醇。用水取代水解产物后,相对于空白对照检测在 570 nm 处的吸收值。
3. 校准曲线
为了定量,用 12 份(1~50 ul,补充至 200 ul)10 mmol/L 亮氨酸溶液绘制校对曲线。
常见问题
试剂:
0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.0,包含 10 mmol/L CaCl2(1.47 g CaCl2·2 H2O 溶于 1 L)
0.2 mol/L NaOH(Mr=40.0;0.8 g 溶于 100 ml H2O)
0.2 mol/L 乙酸(Mr=60.05;12 g 溶于 1 L)
1.2 mol/L 三氯乙酸(TCA,Mr=163.4;19.6 g 溶于 100 ml H2O)
酪蛋白底物:2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl2 和0.2 mol/L NaOH,而后用 0.2 mol/L 的乙酸调 pH 至 8.0,并用 H2O 将溶液补充至 100 ml。溶液被分为等分试样并储存于 -20℃。
2 mol/L 乙酸缓冲液,pH 5.4[溶解 270 g 三水乙酸钠(C2H3O2Na·3H2O,Mr=136.1)于 200 ml H2O,加 50 ml 冰醋酸并补充至 1 L]
10 mmol/L KCN(Mr=65.1;65 mg 溶于 100 ml H2O);
0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液(0.2 ml 10 mmol/L KCN+9.8 ml 乙酸缓冲液,新鲜制备)茚三酮试剂(2,2-二羟基-1,3-茚满二酮,Mr=178.1,可购买到)
50% 乙醇
标准 BSA 溶液,40 ug/ml,将储存液稀释 100 倍,100 mg 溶于 25 ml 水中制备而得。
10 mmol/L 亮氨酸(DL-亮氨酸,Mr=131.2;131 mg 溶于 100 ml 水中)
蛋白酶溶液