SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、仪器与试剂

1、材料：

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。

2、试剂：

（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）

（2）10%的SDS溶液

（3）10%的过硫酸铵溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8

（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8

（7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3

（8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰

（9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液

（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液

（11）标准分子量蛋白。

3、仪器设备：

电泳仪、垂直电泳槽等。