双向电泳各步骤注意事项

1. 总的策略

① 化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求

② 使用去离子水(电导<2uS)

③ 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制

④ Deionize urea prior to use

⑤ 包含尿素的溶液加热温度不超过 37℃，否则会发生蛋白质氨甲酰化 nbsp;过滤所有的溶液，使用干净无灰尘的容器

2. 样品制备

① 样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成 1ml，于-78℃冷冻保存， 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻

② 如有必要，在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。注意：几种蛋白酶抑制剂在 DTT 或b-巯基乙醇存在时失效

③ 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物

3. 灌胶

① 过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2-3天，低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用

② TEMED 需在氮气下储存，每 6 个月换一次

③ 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理，避免胶聚合后与玻璃板粘连

④ 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗

⑤ 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上， GelBond PAG 膜需用去离子水洗 6 次，每次 10 分钟， 以避免银染过程中产生点托尾

4. IPG 胶条的水化

① PG 胶条需水化到 0.5mm 厚

② IPG 胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高，至少需水化 6 小时，最好过夜

③ 采用 Multiphor II 做第一向电泳时，水化后的 IPG胶条需用去离子水清洗，否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰 IEF。(使用 IPGphor 时，IPG胶条水化后不必清洗)

④ IPG 胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发

5. 第一相 IEF

① 采用样品杯上样：样品体积不能少于 20μl 样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好；样品浓度不能过高(最大 10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中

② 水化时加入样品 样品溶液体积需根据 IPG胶条大小调整(18cm长 IPG胶条约需 400μl样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG胶中

③ 等电聚焦 使用 IPG 胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条；为使样品进入胶的效率增加，采用 30V 低电压水化；继续以低电压梯度(200V，500V，1000V 各 1 小时)进行电泳，最后达到 8000V 的进行电泳；聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG胶条或宽 pH 梯度范围 IPG 胶条，聚焦时间短 IEF 结束后，如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78℃ 冷冻保存；上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间

6. IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)

① 平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟)

② 平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中，DTT 会导致点拖尾)

③ 对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效

④ 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗

⑤ 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过 25mm

⑥ 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行(场强<10V/cm)