PriCells: 正常小鼠腹股沟脂肪垫获取脂肪源干细胞

实验材料：

1. Hank’s缓冲盐溶液（HBSS）；

2. ASC培养基：含10%胎牛血清的DMEM，添加1%的P/S；

3. 胶原酶溶液：100ml Hank’s缓冲盐溶液中加入1g牛血清白蛋白和0.1gⅡ型胶原酶；

4. 聚乙烯吡咯酮碘溶液；

5. 陪替氏培养皿，9cm；离心管，50ml；组织培养瓶，25cm2；

6. 剪刀（2把），镊子（2把）；

7. PBSA；

8. 小鼠，4—6只；

9. 麻醉剂：三溴乙醇；

实验方法：

1. 37℃水浴中预热HBSS和脂肪源干细胞培养基；

2. 麻醉动物后处死；

3. 转移动物至层流净化罩中；

4. 70%酒精消毒腹部；

5. 采用低位横向切口打开腹腔；

6. 用镊子取出性腺/附睾和腹股沟处的脂肪垫；

7. 将脂肪组织置于培养皿中，加入HBSS；

8. 待所有动物脂肪取出后，将脂肪转移至新的培养皿中；

9. 加入含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS 2—3min；

10. 漂洗组织并用HBSS洗涤脂肪；

11. 用无菌镊子将脂肪转移至50ml离心管中；

12. 用无菌剪刀将脂肪切碎；

13. 加入与组织体积相同的胶原酶溶液并混匀；

14. 将离心管置于37℃水浴中60min，其间不时混匀一下；

15. 离心，50—100g，5min；

16. 取出离心管，用力摇晃（将基质细胞与原代脂肪细胞完全分离），再次离心5min；

17. 小心吸去上层油脂，油脂层中含有原代脂肪细胞，注意不要破坏位于下方的基质—血管细胞层；

18. 加入5—10ml PBSA，重悬沉淀，再次离心5min；

19. 洗涤三次，注意不要吸走基质—血管细胞层；

20. 最后一次洗涤后，加入8ml ASC培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃，5%CO2温箱中；

21. 待细胞贴壁生长2—4天后换液；

22. 换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞；

23. 以后每周更换培养基2次；