乙醇脱氢酶的测定实验-还原反应测定

ADH 反应：

乙醛 + NADPH + H+ ⇌ 乙醇 + NAD+

此反应是可逆的，并且可以从两个位点检测出来，平衡常数是 8×1012 mol/Ｌ。乙醇的生成是人们希望看到的，由此可以更为简单地检测这个方向的反应进程。但是也有极为不利的因素，即乙醛的毒性以及此反应速度过快。

材料与仪器

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

0.98 ml 的实验混合物

0.02 ml ADH（0.02 IU）

25 ℃ 时，于 340 nm 处吸收值降低。为了方便量化，经常使用 NADH 的吸收系数 ε340＝6.3×103 l/（mol·cm）。

常见问题

试剂：

0.1 mol/L 磷酸钾，pH 7.5

0.1 g BSA 溶于 100 ml 0.1 mol/L 磷酸钾溶液中，pH 7.5（BSA 溶液）

0.01 mol/L NADH（71 mg 溶于 10 ml H2O）

0.5 mol/L 乙醛，2.2 g（2.82 ml）溶于 100 ml H2O

用 BSA 溶液稀释 ADH：按照其活性，商业购买的酶需要被稀释，例如 0.02 IU 的 ADH 每分钟转化 0.02 mol NADH，相当于吸收值变化 0.126，这是一个对反应来说很方便的数值。对于 400 IU/mg 购买的 ADH，也许需要将 10 mg/ml（4000 IU/ml）的原料溶液溶于 pH 7.5、0.1 mol/L 的磷酸钾中。然后，稀释溶液 4000 倍（2.5 ul 溶于 10 ml BSA 溶液中），使其最终为 1 IU/ml。取出 20 ul 做酶的测定实验。