琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用实验-甲烯蓝脱色法

琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，并将脱下的氢交给受氢体。用甲烯蓝作受氢体时，甲烯蓝被氢还原生成无色的甲烯白。其反应如下：
 
琥珀酸+甲烯蓝→延胡索酸+甲烯白+蓝酸
 
丙二酸是琥珀酸脱氢酶竞争性抑制剂细菌量越多或脱氢酶活性越高甲烯蓝脱色所需时间越短，因此，甲烯蓝脱色所需时间的倒数可用来表示酶的活性或细菌生长的情况。

材料与仪器

大肠杆菌
琥珀酸钠 甲烯蓝 磷酸 丙二酸溶液 液体石蜡
试管 吸量管 电热水浴锅

步骤

（一）琥珀酸脱氢酶活力检查
1. 在1支斜面菌种管中加入约5 ml，0.15 mol/L，pH7.3缓冲液，用玻璃棒刮下斜面上的菌体，振荡，倒入离心管中，2500 r/ min离心5 min，倾出洗涤液，菌体再加入6 ml，0.15 mol/L，pH7.3磷酸缓冲液，振荡，制成菌悬液待用。
 
2. 取两支试管各加入1 ml 0.02 mol/L琥珀酸钠溶液，1 ml，pH7.3，0.15 mol/L磷酸缓冲液，0.3 ml，0.001  mol/L甲烯蓝溶液。在1支试管中加入1 ml菌悬液，另一支试管加入已煮沸5 min的菌悬液1 ml（冷却后加入）作对照。混匀立即加入0.5～1 ml液体石蜡。
 
3. 将试管于37 ℃水浴恒温反应，观察记录甲烯蓝变色所需时间。
 
（二）丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用
 
取3支试管编号，按下表加入试剂：

注意事项

①第三管加入的菌液预先用沸水煮5 min作为对照管；
②观察变色时不要振动试管，以免氧气漏入管内影响变色；
③由于甲烯蓝容易被空气中的氧氧化，所以实验需在无氧条件下进行。可用液体石蜡封闭反应液。