脾脏单个核细胞悬液的制备

(1)大鼠断颈处死后，无菌取脾置于消毒平皿中称重;

(2)超净工作台上置10cm直径无菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液 ，置一80目的不锈钢筛于平皿中，脾脏置于筛网中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器针芯轻轻捻磨脾脏，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中， D-hanks冲洗一次；

(3)用吸管吸取冲洗液，200目的钢筛过滤一次后收集至离心管中；

(4)1000rpm，离心5～10min，弃上清；

(5)加入约1ml双蒸水，吸管打匀后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks调节渗透平衡，以***红细胞，但对白细胞没有影响；用D-hanks液洗涤细胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、10%的胎牛血清的RPMI－1640重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，台盼兰染色检测细胞存活率大于95％；

(7)接种至培养板或培养瓶中。