眼表及角膜病动物模型-卵白蛋白诱导变应性结膜炎动物模型

结膜炎（conjunctivitis）是眼科最常见的疾病之一，根据其致病原因可分为微生物性和非微生物性两大类。最常见的是微生物感染（常见的有细菌、病毒和衣原体等，也可见真菌、立克次体和寄生虫等）、物理性刺激（如风沙、烟尘、紫外线等）和化学性损伤（如药品、酸碱或有毒气体等）、免疫性病变（过敏性）、邻近组织的炎症刺激等。变应性结膜炎（allergic conjunctivitis）也称为过敏性结膜炎。它是由眼部组织对变应原产生超敏反应所引起的炎症。实验性变应性结膜炎可通过给大鼠或豚鼠腹腔注射卵白蛋白使其产生 IgE 抗体，该抗体可与结膜组织中肥大细胞的 Fc 受体结合而致敏。还可用豚草粉（ambrosia artemisiaefolia）反复接触豚鼠或小鼠鼻黏膜及结膜，刺激结膜组织产生特异性 IgE 抗体，致附着于结膜的肥大细胞 Fc 受体使之主动过敏。

原理

将卵白蛋白给大鼠腹腔注射，使其产生 IgE 抗体，IgE 与结膜组织中肥大细胞的 Fc 受体结合而致敏。当用抗原局部攻击时，引起激活的肥大细胞脱颗粒释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加和局部嗜酸性粒细胞浸润。DL-二巯基苏糖醇（DDT）是黏液溶解剂，它可以破坏结膜黏液的屏障功能，使卵白蛋白这种大分子物质能够穿透入结膜，与组织内的 IgE 抗体结合，增加眼部变态反应。

用途

此模型是抗 I 型变态反应药物常用的筛选方法，此方法具有客观、简便、快速（攻击后 10 分钟即出现明显的结膜炎症状，30 分钟达高峰，1 小时后消失）、可定量等特点，筛选的效果与临床效果基本一致。

材料与仪器

实验对象：大鼠实验器材：裂隙灯显微镜实验试剂：① 卵白蛋白磷酸缓冲液（PBS）；② DDT；③ 0.125% 伊文思蓝。

步骤

卵白蛋白诱导变应性结膜炎动物模型的基本过程可分为如下几步：A. 给大鼠腹腔注射卵白蛋白磷酸缓冲液（PBS）1 ml（含卵白蛋白 100 ug，硫酸铝钾 10-20 mg，pH7.4）免疫。B.14 天后各眼滴 1mol/L DDT 10～20 μl，以消除结膜黏液屏障，提高攻击效果。C.15 分钟后，对于判断血管通透性变化的动物静脉注射 0.125% 伊文思蓝（1.25 mg/100 g）1 ml，并立即用 5% 卵白蛋白 PBS 液 10 μl 滴眼攻击。对于判断临床及组织学改变的动物，仅用 5% 卵白蛋白 PBS 液 10 μl 滴眼攻击即可，不注射伊文思蓝。

注意事项

一. 此模型的眼部临床观察

局部抗原攻击后 30 分钟，裂隙灯显微镜下判定组织反应，用以下计分法对反应定量评估（每眼最多 10 分）。（1）充血（睑结膜和球结膜）0：正常；1：结膜轻度充血，呈粉红色；2：结膜呈红色；3：结膜呈暗红色，有瘀点或瘀斑。（2）水肿0：无；1：仅下眼睑水肿；2：上下眼睑均水肿，眼睑部分闭合；3：眼脸外翻，水肿明显，眼睑至少半关闭；4：上下眼睑及睑缘均水肿。（3）分泌物0：无；1：稀黏液状；2：眼睑及周围的毛发潮湿；3：眼睑及周围的毛发潮湿，稠黏液状。

二. 血管通透性判断

抗原攻击后 20～30 分钟，处死动物，摘除眼睑、结膜和眼球，去除脂肪组织，称重。将组织分别置于 0.5% 硫酸钠和丙酮液（3:7 混合）内 5～10 ml，室温下振荡，24 小时后将溶液于 300 r/min 离心 10 分钟，取上清液用分光光度计在 620 nm 处测定光密度. 依组织称重换算为伊文思蓝含量（ug/g）。

三. 组织学检查

抗原攻击 30 分钟后，切除上方球结膜制备光镜标本，将组织固定在 Karnovsky 固定液中，乙醇梯度脱水，异丁烯酸乙二醇包埋，切片厚 2 μm，HE，PAS 及 Giemsa 染色，光镜观察。用网格为 0.25 mm × 0.025 mm 的网状计数尺在 3 个不同的视野内对结膜上皮、上皮下组织及基质组织中的肥大细胞和嗜酸性粒细胞计数。阳性组结膜上皮内及基质内嗜酸性粒细胞大量浸润，脱颗粒的肥大细胞明显增多，脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数之比值明显增高。