肝微粒体制备

肝微粒体制备，是由肝组织勾浆经超速离心得到的内质网碎片形成的小泡，适各代谢酶催化的生物转化反应和抑制研究。通过向孵育体系中添加不同的辅因子，研究体外代谢实验。

原理

肝微粒体制备的基本原理是通过向孵育体系中添加不同的辅因子，研究或区分细胞色素 P450（CYP）、黄素单加氧酶（FMO）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）等体外代谢实验。

用途

肝微粒体制备可用于研究研究体外代谢。

材料与仪器

器材：

① 内切式匀浆机、高速离心机、超速离心机

② 表面皿数个、冰袋数个

③ 碎冰

④ 烧杯、匀浆用玻璃管

⑤ 不锈钢剪刀、（双光束） 紫外分光光度计、CO 通气设备

试剂：

① 0.15 mol/L KCI 的 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 （pH 7.4）

② 10 mmol/L 磷酸钾级冲液 （pH 7.4）

③ 2％ 碳酸钠溶液 （用 0.1 mol/L NaOH 配制）

④ 0.5％ 硫酸铜 （用 1％ 酒石酸钾配制）

⑤ 牛血清白蛋白 （BSA） 标准液 500 ug/ml（用 0.1 mol/L NaOH 配制）

⑥ 酚试剂：连二亚硫酸钠溶液 （0.1 g/ml）

步骤

肝微粒体制备的实验步骤如下：

A、组织用含 0.15 mol/L KCI 的 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 （pH 7.4） 内切式匀浆机匀浆。

B、9000×g 离心 20分钟，取上清。

C、超速离心机 105000×g 超速离心 60 分钟。

D、取沉淀重悬于 100 mmo/L 磷酸钾缓冲液 （pH 7.4） 中，105000×g 超速离心 60 分钟，取沉淀，即微粒体。

E、将人肝微粒体中底部的油状物质与上层的蛋白质分开储存。

F、将微粒体重悬于少量磷酸钾缓冲液 （pH 7.4，100 mmol/L） 中。

G、临用时取 2％ 碳酸钠溶液 50 ml，加 0.5％ 硫酸铜 1 ml，混匀（甲液），放 50 ℃ 水浴 10 分钟 （或室温 30 分钟），冷却后，680 mm 比色，计算每 1 ml 中蛋白含量，将各管微粒体贮存液稀释成等浓度蛋白悬液（测定管和标准管均平行做两），建立蛋白浓度标准曲线。

H、微粒体悬液在 0.1 mo/L 磷酸缓冲液 （pH7.4） 中稀释至 0.5 mg/ml 各取 3 ml 加人两比色杯中，紫外分光光度计 500~400 nm 波长区间扫描并做基线校正，各杯中加入连二亚硫酸钠溶液 （0.1 g/ml）20 ul。

I、迅速向测定管内充 CO 30~60 秒 （充气速度要慢，防止起泡沫），稳定 5 分钟后，在 500~400 nm 波长区间再次进行扫描测定，得到还原型细胞色素 P450 的吸光度 （OD） 值。

J、计算细胞色素 P450 含量。