家兔配子和卵巢冷冻保存技术-家兔卵母细胞的冷冻保存

冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于-196 ℃液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。

适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。

除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

材料与仪器

器材：

①冻存管

②程序降温仪

③37 ℃水浴锅

④镊子

试剂：

①材料：家兔卵母细胞

②培养液

③DMSO

④液氮

步骤

家兔卵母细胞的冷冻保存的基本过程可分为如下几步：

1．家免卵母细胞的程序化冷冻

（1）室温下先将卵母细胞放入装有0.1 ml培养液的冻存管内，每个冻存管放入5～10个胚胎或卵母细胞。

（2）将2.5 mol／L的DMSO分3次加入冻存管中，每次0.05 ml，每次间隔5分钟，DMSO的最终浓度为1.5 mol／L，然后将冻存管封口。

（3）大约15分钟后，将冻存管放入预冷到15 ℃的程序降温仪，以1 ℃hnin降至-5 ℃，平衡3分钟，用已经在液氮中预冷的镊子在冻存管外液面处夹一下玻璃以诱发结晶。

（4）继续平衡5分钟，然后以8-10分钟的速率降至-20 ℃，平衡10分钟，再以同样的降温速率降至-100 ℃，10分钟后投入液氮中进行长期保存。

2．程序化冷冻家兔卵母细胞的复苏

（1）在复苏卵母细胞时，将冻存管从液氮中取出，迅速放入37 ℃水浴中快速振荡，待冰晶融化后即将冻存管移至室温。

（2）复温率大约为500 ℃／min。室温下3分钟后，分3次向冻存管内加入0.2 ml，0.2 ml，0.4 ml的培养液，每次间隔10分钟。

（3）然后将卵母细胞吸至培养皿内，用培养液冲洗3遍，以完全除去DMSO。