单酶单DNA样品消化

1.  混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中

（1）x μl  DNA

（2）2 μl  10×酶切缓冲液

（3）18-x μl  H2O

（4）20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。

（5）只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可增减待切割DNA的量和反应条件。

2.  加入限制性内切酶（1——5 U/μg DNA）在推荐的温度温育1 h （—般是37℃）。

3.  理论上，1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下，60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。

4.  酶的体积应低于反应总体积的1/10，因为酶液中的甘油可以干扰反应。

5.  加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.  反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（终浓度为12. 5 mol/l） 以螯合镁离于而终止。

7.  很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活，有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。

8.  如果酶对热具完全抗性，可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。

1.分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

2.要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。

3.凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。

4.当样品在37℃与65℃保温时，要注意：

（1）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。

（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。

5.由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。