用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验
材料与仪器结合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白碱性缓冲液 封闭缓冲液 相互作用缓冲液PK 缓冲液 还原型谷胱甘肽于 Tris-Cl中 洗涤缓冲液 1 洗涤
材料与仪器
结合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白
碱性缓冲液 封闭缓冲液 相互作用缓冲液PK 缓冲液 还原型谷胱甘肽于 Tris-Cl中 洗涤缓冲液 1 洗涤缓冲液 2 蛋白酶 蛋白激酶 A [y-32P]ATP
与待筛选蛋白结合的膜或滤膜 Sephadex G-50 转柱
碱性缓冲液 封闭缓冲液 相互作用缓冲液PK 缓冲液 还原型谷胱甘肽于 Tris-Cl中 洗涤缓冲液 1 洗涤缓冲液 2 蛋白酶 蛋白激酶 A [y-32P]ATP
与待筛选蛋白结合的膜或滤膜 Sephadex G-50 转柱
步骤
材料
缓冲液和溶液
将缓冲液稀释到适当浓度。
碱性缓冲液
20 mmol/L HEPES(pH7.5)
50 mmol/LKCl
10 mmol/LMgCl2
1 mmol/L 二硫苏糖醇
0.1%NP-40
封闭缓冲液
5% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中
相互作用缓冲液
1% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中
2xPK 缓冲液
100 mmol/LKPO4(英文版原书如此—译者注）
20 mmol/LMgCl2
10 mmol/LNaF
9 mmol/L 二硫苏糖醇
还原型谷胱甘肽（20 mmol/L) 于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
可选，请见步骤 3
洗涤缓冲液 1
磷酸缓冲盐溶液，含 0.2%TritonX-100
洗涤缓冲液 2
磷敢缓冲盐溶液，含 0.2%TritonX-100 和 100 mmol/LKCl
酶及缓冲液
蛋白酶
可选，请见步骤 3。
蛋白激酶 A
每次使用时按产品说明新鲜配制。
放射活性化合物
[y-32P]ATP(6000Ci/mmol)
专用设备
与待筛选蛋白结合的膜或滤膜。
请见步骤 5。
Sephadex G-50 转柱
可选，请见步骤 4。
附加试剂
此方案步骤 3 需要一些试剂，它们可将融合蛋白从其载体上或结合的谷胱甘肽-琼脂糖上切割下来，见 15 章方案 5。
此方案步骤 5 需要含待检测蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶（请见附录 8) 或含 cDNA 表达文库的板（请见 14 章方案 2），以及附录 8 中描述的免疫印迹试剂。
单独的 GST 或一种非特异性蛋白质的阴性对照应当和靶蛋白一起加入到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中。如果目标蛋白是一保守家族的成员，目标蛋白的相互作用可与同一家族的其他蛋白质进行比较。
载体和菌株
结合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白
这一方案适合于融合蛋白中含蛋白质激酶磷酸化位点的蛋白质（Ron and Dressler 1992)。还可采用含 cAMP 依赖的蛋白激酶识别序列的载体（Amersham Pharmacia Biotech 公司）。如果使用非标记的 GST 融合蛋白，请参见本方案结束处的文本框，“替代方案：用抗 GST 抗体检测蛋白质-蛋白质相互作用”。
方法
放射标记蛋白探针的制备
1. 在微量离心管中制备下列反应混合物：
[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol） 5ul
蛋白激酶 A 1unit/ul
在谷胱甘肽琼脂糖上的 GST 融合蛋白 1~3ug
2XPK 缓冲液 12.5ul
水 到 25ul
反应混合物在 37°C 孵育 30 min。
在标记反应进行前融合蛋白可被蛋白酶切割。在此情形下，用切割蛋白替代标记反应中结合到谷胱甘肽琼脂糖上的蛋白质，37°C 孵育 30 min, 然后接续步骤 4。
GST 成分保留在融合蛋白上，要用 GST 本身（结合到谷胱甘肽琼脂糖）做对照重复此实验。在文库筛选时这可能不太实际，因此重要的是测试阳性克隆与 GST 本身结合的能力。这一对照通常在第四次纯化后、克隆鉴定前进行。
2. 标记反应完成后，加入 200ul 的 1XPK 缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心 1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。
3. 用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用 20 mmol/L 还原型谷胱甘肽于 50 mmol/LTris (pH8.0) 中（请见 15 章方案 5) 将标记的 GST 融合蛋白从琼腊糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
4. 在标记反应前如果标记蛋白与 GST 成分分开（请参见步骤 1 的注意事项)，就将标记蛋白上用 1XPK 缓冲液平衡的SephadexG-50 柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
探测膜
5. 用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。
从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移的蛋白质通常可以直接被检测。如果蛋白质从 cDNA 表达文库中转移，则在进入到步骤 6 之前，可要进行附加方案：“膜结合蛋白的再折叠”。
6. 用碱性缓冲液完全覆盖膜并在 4°C 轻轻震荡淸洗 10 min。
7. 弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 4 h 到过夜。
8. 加人 1~3ug 的贮存探针（来自步骤 3 或 4) 到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为 1~5nmol/L, 制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4°C 轻轻震荡孵育 4~5 h。
9. 以适当的方式弃去放射性探针溶液。用洗漆缓冲液 1 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 10 min。重复洗涤三次。
10. 用洗涤缓冲液 2 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡洗涤 10 min。重复洗涤一次。
11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。
缓冲液和溶液
将缓冲液稀释到适当浓度。
碱性缓冲液
20 mmol/L HEPES(pH7.5)
50 mmol/LKCl
10 mmol/LMgCl2
1 mmol/L 二硫苏糖醇
0.1%NP-40
封闭缓冲液
5% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中
相互作用缓冲液
1% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中
2xPK 缓冲液
100 mmol/LKPO4(英文版原书如此—译者注）
20 mmol/LMgCl2
10 mmol/LNaF
9 mmol/L 二硫苏糖醇
还原型谷胱甘肽（20 mmol/L) 于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
可选，请见步骤 3
洗涤缓冲液 1
磷酸缓冲盐溶液，含 0.2%TritonX-100
洗涤缓冲液 2
磷敢缓冲盐溶液，含 0.2%TritonX-100 和 100 mmol/LKCl
酶及缓冲液
蛋白酶
可选，请见步骤 3。
蛋白激酶 A
每次使用时按产品说明新鲜配制。
放射活性化合物
[y-32P]ATP(6000Ci/mmol)
专用设备
与待筛选蛋白结合的膜或滤膜。
请见步骤 5。
Sephadex G-50 转柱
可选，请见步骤 4。
附加试剂
此方案步骤 3 需要一些试剂，它们可将融合蛋白从其载体上或结合的谷胱甘肽-琼脂糖上切割下来，见 15 章方案 5。
此方案步骤 5 需要含待检测蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶（请见附录 8) 或含 cDNA 表达文库的板（请见 14 章方案 2），以及附录 8 中描述的免疫印迹试剂。
单独的 GST 或一种非特异性蛋白质的阴性对照应当和靶蛋白一起加入到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中。如果目标蛋白是一保守家族的成员，目标蛋白的相互作用可与同一家族的其他蛋白质进行比较。
载体和菌株
结合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白
这一方案适合于融合蛋白中含蛋白质激酶磷酸化位点的蛋白质（Ron and Dressler 1992)。还可采用含 cAMP 依赖的蛋白激酶识别序列的载体（Amersham Pharmacia Biotech 公司）。如果使用非标记的 GST 融合蛋白，请参见本方案结束处的文本框，“替代方案：用抗 GST 抗体检测蛋白质-蛋白质相互作用”。
方法
放射标记蛋白探针的制备
1. 在微量离心管中制备下列反应混合物：
[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol） 5ul
蛋白激酶 A 1unit/ul
在谷胱甘肽琼脂糖上的 GST 融合蛋白 1~3ug
2XPK 缓冲液 12.5ul
水 到 25ul
反应混合物在 37°C 孵育 30 min。
在标记反应进行前融合蛋白可被蛋白酶切割。在此情形下，用切割蛋白替代标记反应中结合到谷胱甘肽琼脂糖上的蛋白质，37°C 孵育 30 min, 然后接续步骤 4。
GST 成分保留在融合蛋白上，要用 GST 本身（结合到谷胱甘肽琼脂糖）做对照重复此实验。在文库筛选时这可能不太实际，因此重要的是测试阳性克隆与 GST 本身结合的能力。这一对照通常在第四次纯化后、克隆鉴定前进行。
2. 标记反应完成后，加入 200ul 的 1XPK 缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心 1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。
3. 用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用 20 mmol/L 还原型谷胱甘肽于 50 mmol/LTris (pH8.0) 中（请见 15 章方案 5) 将标记的 GST 融合蛋白从琼腊糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
4. 在标记反应前如果标记蛋白与 GST 成分分开（请参见步骤 1 的注意事项)，就将标记蛋白上用 1XPK 缓冲液平衡的SephadexG-50 柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
探测膜
5. 用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。
从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移的蛋白质通常可以直接被检测。如果蛋白质从 cDNA 表达文库中转移，则在进入到步骤 6 之前，可要进行附加方案：“膜结合蛋白的再折叠”。
6. 用碱性缓冲液完全覆盖膜并在 4°C 轻轻震荡淸洗 10 min。
7. 弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 4 h 到过夜。
8. 加人 1~3ug 的贮存探针（来自步骤 3 或 4) 到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为 1~5nmol/L, 制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4°C 轻轻震荡孵育 4~5 h。
9. 以适当的方式弃去放射性探针溶液。用洗漆缓冲液 1 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 10 min。重复洗涤三次。
10. 用洗涤缓冲液 2 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡洗涤 10 min。重复洗涤一次。
11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。
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