脉冲场凝胶电泳制备DNA（酵母完整DNA的分离）

制备用于电泳的酵母 DNA，先用酶破坏酵母细胞胞壁，然后在熔化的低熔点琼脂糖中混悬，制成栓。将栓浸入含蛋白酶的裂解缓冲液，以加速细胞裂解和除去蛋白质。此方法在 Schwartz 和 Cantor (1984) 最初介绍的方法上略有改进，它可用于制备作为 高分子质量标准的酵母染色体和酵母人工染色体（YAC)。

酵母混悬培养物
细胞清洗缓冲液 EDTA L 缓冲液 TE 酵母裂解缓冲液 酵母细胞壁消化酶 酶解酶
低熔点琼脂糖 Sorvall GSA 转头或相当型号的转头 预成型的 Plexiglas 模具

一、材料

1. 缓冲液和溶液

细胞清洗缓冲液（0.01 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，0.05 mol/L EDTA ( pH 8.0)，室温存放。）

EDTA ( 0.05 mol/L, pH 8.0)

L 缓冲液（0.1 mol/L EDTA ( pH 8.0)，0.01 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，0.02 mol/L NaCl，4℃ 存放）

含蛋白酶 K 和十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl) 的 L 缓冲液

TE（pH 7.6）

含 40 μg/ml PMSF 的 TE（pH 7.6）

酵母裂解缓冲液（0.01 mol/L Tris-Cl（pH 7.6），0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），β-巯基乙醇（1% V/V））

酵母细胞壁消化酶

酶解酶（Zymolyase）5000（Kirin Breweries）或溶细胞酶（Lyticase）（67 mg/ml）（Sigma）

2. 凝胶

低熔点琼脂糖（1%）

3. 离心机和转头

Sorvall GSA 转头或相当型号的转头

4. 专用设备

预成型的 Plexiglas 模具（50~100 μl，Pharmacia 或 Bio-Rad), 或一个长的 Tygon 管（1/8 英寸或内径 3.2 mm), 或一个塑料注射器（1 ml）。

5. 细胞和组织

酵母混悬培养物

二、方法

1. 3000 g ( Sorvall GSA 转头 4300 r/min) 4℃ 离心 5 min 收集混悬培养的酵母细胞。用细胞清洗缓冲液洗两次细胞沉淀。

2. 混悬细胞于 0℃ 的 0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）中，浓度 3X109 个细胞/ml。

3. 用 L 缓冲液配制 1% 低熔点琼脂糖。熔化后，冷却至 42℃。

4. 加 75 μl 酶解酶或溶细胞酶溶液到步骤 2 的细胞混悬液内，混匀。

5. 加热细胞混悬液至 42℃。将 5 ml 熔化的琼脂糖和 5 ml 细胞混悬液混合。用一个封口的巴斯德吸管搅匀混合物，以保证细胞完全分散在琼脂糖中。

6. 混合物移入预成形的 Plexiglas 模具（50~100 μl，Pharmacia 或 Bio-Rad), 或吸混合物到合适长度的 Tyson 管（内径 3/32 英寸）内，也可以吸入 1 ml 塑料注射器内。室温放置 15 min，再移至 4℃ 放 15~30 min。

7. 琼脂糖凝固后，从 Plexiglas 模具收集凝胶栓，或从 Tygon 管和注射器挤出凝胶。将圆柱形凝胶栓切成 1 cm 长的段。

8. 3 倍体积酵母裂解缓冲液内 37℃ 温育凝胶块 3 h，化学通风橱内进行。

9. 干净培养皿内加入 3 倍体积含有 0.1 mg/ml 蛋白酶 K 和 1% ( m/V）Sarkosyl 的 L 缓冲液。移入凝胶块，50℃ 温育 3 h。用新鲜等体积上述缓冲液替换旧的，继续 50℃ 温育 12~16 h。

10. 在 50 倍体积含 40 μg/ml PMSF 的 TE ( pH 7.6) 50℃ 温育凝胶块 1 h。用新鲜等体积上述溶液替换旧的，继续 50℃ 温育 1 h。

11. 除去含 PMSF 的 TE, 用新鲜等体积 TE ( pH 7.6) 室温继续温育 1 h。