通过超滤去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过剩dNTP

PCR 反应结束后，从扩增 DNA 产物中去除扩增反应残余下来的寡核苷酸引物，引物二聚体及 dNTP 是非常必要的。首先，DNA 扩增目的产物内残余的 dNTP 可以在剩余热稳定 DNA 聚合酶的作用下填平已被限制性内切核酸酶切割产生的 DNA 产物的黏末端，使后者难以被进一步克隆。其次，过量的寡核苷酸引物可导致用第一次 PCR 扩增的 DNA 产物作模板再进行第二次 PCR 扩增反应的效率降低。最后，引物二聚体内部的众多的限制性核酸内切酶酶切位点可与扩增 DNA 片段两末端的酶切位点竞争限制性核酸内切酶，从而影响扩增 DNA 片段的薄切效率。

扩增反应产物
氯仿 乙醇 乙酸钠 TE
制备性离心机或小型离心机 浓缩器

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

乙醇

乙酸钠（3 mol/L)

TE ( pH 8.0)

2. 核酸和寡核苷酸

扩增反应产物（20~200 μl)

3. 离心机和转头

制备性离心机或小型离心机

4. 特殊设备

浓缩器 （Centricon-100 orMicrocon-100，Amicon)

二、方法

1. 放置 2 ml TE ( pH 8.0) 在 Cemricon-100 浓缩器的贮液腔内。用移液器小心地从上层矿物油下面抽取扩增反应产物，或者用氯仿抽提反应管内的样品。

2. 放置转移扩增反应产物到 Centricon-100 浓缩器的贮液腔内。浓缩装置至制备性离心机的合适转头上（如固定直角转头)。将这种微量浓缩器用一只过滤杯插入离心机上，过滤杯的半透明部分朝向转头的底部。使用另一只充满等量液体的浓缩器或标准平衡管作为相对应的平衡物。

3. 上样后的浓缩器用 1000 g 离心力离心 30 min，温度在 4℃ 至 25℃。

4. 把浓缩器从离心机上卸下，弃半透明过滤杯中的液体，转换浓缩器，放回到离心机上（即现在浓缩潲留液管的放置应该朝向转头的底部 )。再用 300~1000 g 离心 2 min。

5. 把浓缩器从离心机上卸下；取出浓缩潴留液，弃浓缩器装置内的残余液体。转移浓缩潴留液管内的浓缩液到一只新的离心管内。

6. 如果必要，可用 1/10 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2~3 倍体积的乙醇沉淀浓缩潴留液管内的样品。这种经离心透析得到的样品可用于后续进一步操作（如 DNA 测序和连接反应)。应用 Centricon-100 滤膜浓缩器进行一步离心透析，可去除 PCR 扩增 DNA 样品中 95% 的残余引物和寡核苷酸，同时这个透析过程也能使热稳定 DNA 聚合酶失活（可能是滤膜吸附作用引起的）。通常单独一步纯化即可满足扩增 DNA 后续的分子操作要求。如果必要，痕迹量的寡核苷酸引物可用第二轮的 30 min 离心透析步骤予以去除。在上述步骤 4，倒空半透明过滤杯中的液体，重新装配浓缩器，另加 2 ml TE ( pH 8.0) 至贮液腔中，重复步骤 2 至 4。

较小规模快速纯化扩增产物也能应用 Cemricoti-100 滤膜浓缩器。总的操作步骤是与 Centricon-100 浓缩器相类似的，除了在步骤 1，加入贮液腔内 400 μl TE，接着加入 PCR 扩增样品 20~100 μl。

在一台变速离心机上用 3000 g 进行 5~7 min 离心。将滤出液去除，浓缩液样品转移至潴留液杯内，继续用 300-1000 g 离心 1 min。这个操作过程可去除约 90% 的寡核苷酸引物和脱氧核苷酸，如重复上述过程可进一步纯化扩增的 DNA 样品。