琼脂糖凝胶栓中DNA的限制性内切核酸酶消化
原理从哺乳动物细胞、酵母或细菌分离的染色体 DNA 在琼脂糖栓中可用所需的内切酶消化。低熔点琼脂糖栓的孔足以使内切酶进入，与作为底物的基因组 DNA 相作用。消
原理
从哺乳动物细胞、酵母或细菌分离的染色体 DNA 在琼脂糖栓中可用所需的内切酶消化。低熔点琼脂糖栓的孔足以使内切酶进入，与作为底物的基因组 DNA 相作用。消化后，经 PFGE 分离，然后回收或做 Southern 印迹分析。
材料与仪器
限制酶 基因组 DNA
限制酶缓冲液 TE
脉冲场电泳用的凝胶 水浴
限制酶缓冲液 TE
脉冲场电泳用的凝胶 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
1X 限制酶缓冲液
TE ( pH 7.6)
2. 酶和缓冲液
限制酶
3. 凝胶
脉冲场电泳用的凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
包埋在低熔点琼脂糖栓中的基因组 DNA
5. 专用设备
设定在酶切最佳温度的水浴
二、方法
1. 如果凝胶栓未在 TE 中存放（如通过邮寄收到的凝胶栓或一直存放在 0.5 mol/L EDTA 中的），则在 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育 30 min。转移凝胶栓至新的 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育第二个 30 min。否则直接进行步骤 2。
2. 将凝胶栓移入微离心管，每管加入 10 倍体积相应的 1X 限制酶缓冲液。室温温育 30 min。
3. 除去缓冲液，用 2~3 倍体积新鲜 1X 限制酶缓冲液替代它。每管加入 20~30 单位相应限制酶该酶作用的最佳温度温育；如果是 YAC DNA 温育 3 h, 哺乳动物 DNA 温育 5~6 h。
4. 如果 DNA 只用一种酶消化，消化后将凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE ( pH 7.6) 内。1 h 后按步骤 7 处理。如果 DNA 用一种以上的酶消化，则跳过 TE 温育而进行步骤 5。
5. 如果 DNA 用一种以上的酶消化，加入第二种酶之前再次用相应缓冲液平衡凝胶栓。为了充分平衡，使用自动移液器从每管尽可能多的除去第一个酶的缓冲液，并用 1 ml TE 替代它。除去 TE, 加入新鲜的 1 ml TE。室温存放 30~60 min。轻轻除去 TE。
6. 每管加 10 倍体积第二个 1x 限制酶缓冲液，室温温育 30 min。如步骤 3 描述的进行限制酶消化。最后，每个凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE (pH 7.6) 内 1 h。
7. 用一次性移液器吸头将凝胶栓直接轻轻推入脉冲场凝胶的加样孔（槽）中，电泳分离 DNA 片段。
1. 缓冲液和溶液
1X 限制酶缓冲液
TE ( pH 7.6)
2. 酶和缓冲液
限制酶
3. 凝胶
脉冲场电泳用的凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
包埋在低熔点琼脂糖栓中的基因组 DNA
5. 专用设备
设定在酶切最佳温度的水浴
二、方法
1. 如果凝胶栓未在 TE 中存放（如通过邮寄收到的凝胶栓或一直存放在 0.5 mol/L EDTA 中的），则在 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育 30 min。转移凝胶栓至新的 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育第二个 30 min。否则直接进行步骤 2。
2. 将凝胶栓移入微离心管，每管加入 10 倍体积相应的 1X 限制酶缓冲液。室温温育 30 min。
3. 除去缓冲液，用 2~3 倍体积新鲜 1X 限制酶缓冲液替代它。每管加入 20~30 单位相应限制酶该酶作用的最佳温度温育；如果是 YAC DNA 温育 3 h, 哺乳动物 DNA 温育 5~6 h。
4. 如果 DNA 只用一种酶消化，消化后将凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE ( pH 7.6) 内。1 h 后按步骤 7 处理。如果 DNA 用一种以上的酶消化，则跳过 TE 温育而进行步骤 5。
5. 如果 DNA 用一种以上的酶消化，加入第二种酶之前再次用相应缓冲液平衡凝胶栓。为了充分平衡，使用自动移液器从每管尽可能多的除去第一个酶的缓冲液，并用 1 ml TE 替代它。除去 TE, 加入新鲜的 1 ml TE。室温存放 30~60 min。轻轻除去 TE。
6. 每管加 10 倍体积第二个 1x 限制酶缓冲液，室温温育 30 min。如步骤 3 描述的进行限制酶消化。最后，每个凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE (pH 7.6) 内 1 h。
7. 用一次性移液器吸头将凝胶栓直接轻轻推入脉冲场凝胶的加样孔（槽）中，电泳分离 DNA 片段。
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