噬菌体DNA从噬菌斑到滤膜的转移实验
原理一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法，在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法，包
原理
一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法，在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法，包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。
材料与仪器
λ 噬菌体文库 大肠杆菌铺平板细菌
变性液 中和液 SM+ 明胶 SSPE
LB 或 NZCYM 琼脂平板 LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖 交联设备 微波炉或真空炉 注射针和注射器 硝酸纤维素膜或尼龙膜 水浴
变性液 中和液 SM+ 明胶 SSPE
LB 或 NZCYM 琼脂平板 LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖 交联设备 微波炉或真空炉 注射针和注射器 硝酸纤维素膜或尼龙膜 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
变性液
中和液
SM+ 明胶
2X SSPE
2. 培养基
LB 或 NZCYM 琼脂平板
LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖
3. 专用设备
交联设备（如 Stratgene 公司的 Stratalinker、Bio-Rad 公司的 GS gene Linker)、
微波炉或预置于 80℃ 的真空炉
注射针和注射器（21 号）
硝酸纤维素膜或尼龙膜
预置于 47℃ 和 65℃ 的水浴
防水的黑绘图墨（印度墨）
Whatman 3 MM 纸
Whatman 3 MM 滤纸（直径为 85 mm)
4. 载体和菌株
λ 噬菌体文库
大肠杆菌铺平板细菌
二、方法
滤膜的制备和噬菌斑的转印
1. 转印滤膜的制备：
(1) 用软铅笔或圆珠笔对干滤膜编号。
(2) 将滤膜在水中浸泡 2 min。
(3) 将滤膜叠放在一起，两张滤膜间用直径为 85 mm 的 Whatman 3 MM 滤纸隔开。
(4) 将这一摞滤膜用铝箔包起来，于蒸汽锅（liquild cycle)中 15 psi (1.05 kg/cm2) 高压灭菌 15 min。
2. 将包装混合物、噬菌体原种或文库用 SM+ 明胶进行稀释。将稀释的噬菌体原种与适当量新鲜制备的铺平板细菌混合。感染细菌培养物 37℃ 温育 20 min。
3. 在每份感染细胞中加入 3 ml 或 6.5 ml 熔化的（47℃）顶层琼脂，混匀，倒入独立编号的 90 mm 或 150 mm 琼脂平板中。
4. 盖上平板，使顶层琼脂糖凝固，37℃ 倒置培养，直到噬菌斑出现，并刚刚开始相互接触（10~12 h)。
5. 将平板于 4℃ 至少放置 1 h, 使顶层琼脂糖凝固。
6. 将平板从冷库或冰箱中取出。用第一套标记滤膜影印每个平板的噬菌斑。将标记的干燥、圆形硝酸纤维素膜或尼龙膜放在顶层琼脂糖的表面，使其与噬菌斑直接接触。
7. 在滤膜的四周标记三个或更多个点，用 21 号注射针刺穿这几个点直至下面的琼脂，注入防水的黑绘图墨。
8. 1~2 min 后，用一个平端镊子（如 Milhpore 镊子）依次从每个平板上揭下滤膜。
噬菌体 DNA 在滤膜上的变性
9. 在自助食堂塑料盘中或 Pyrex 平皿中放入一张浸满变性液的 Whatman 3 MM 滤纸 ( 或相当型号），然后将滤膜转移至滤纸上，有噬菌斑的一面朝上，放置 1~5 min。
10. 将滤膜转移至浸满中和液的 Whatman 3 MM 滤纸上，有噬菌斑的一面朝上，放置 5 min。
将噬菌体 DNA 固定在滤膜上
11. 制备用于固定的滤膜。
通过微波或烘烤将 DNA 固定在滤膜上：若用微波炉，则直接按步骤 13 进行； 若在真空炉内烘烤，则将滤膜转移至一张 3 MM 的干滤纸上或一摞纸巾上。在室温滤膜至少干燥 30 min。
通过紫外交联将 DNA 固定在滤膜上：将滤膜置于一张浸泡了 2X SSPE 的 Whatman 3 MM 滤纸上，然后放在紫外交联仪的附近。
12. 如果需要，在第一套滤膜处理完后，用第二套滤膜进行噬菌斑影印。保证两套滤膜以相同位置放入平板。
13. 将 DNA 从噬菌斑固定至滤膜上
通过微波炉处理进行固定：将湿滤膜放在一张干 Whatman 3 MM 滤纸上，微波炉内以最大功率照射 2~3 min。
通过烘烤固定：将干滤膜（步骤 10）摞成一叠，两张滤膜间用干 Whatman 3 MM 滤纸隔开，在真空炉中 80℃ 烘烤 1 ~2 h。
通过紫外交联固定：用市售设备完成该项操作，按照厂家说明书进行。
14. 烘烤或交联后，将干滤膜用铝箔宽松地包起来，保存于室温。另外，若杂交在大约一天内进行，用 0.1X SSC 或 SSPE 和 0.5% SDS 65℃ 洗膜 30 min，湿润保存于封口塑料袋中。
1. 缓冲液和溶液
变性液
中和液
SM+ 明胶
2X SSPE
2. 培养基
LB 或 NZCYM 琼脂平板
LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖
3. 专用设备
交联设备（如 Stratgene 公司的 Stratalinker、Bio-Rad 公司的 GS gene Linker)、
微波炉或预置于 80℃ 的真空炉
注射针和注射器（21 号）
硝酸纤维素膜或尼龙膜
预置于 47℃ 和 65℃ 的水浴
防水的黑绘图墨（印度墨）
Whatman 3 MM 纸
Whatman 3 MM 滤纸（直径为 85 mm)
4. 载体和菌株
λ 噬菌体文库
大肠杆菌铺平板细菌
二、方法
滤膜的制备和噬菌斑的转印
1. 转印滤膜的制备：
(1) 用软铅笔或圆珠笔对干滤膜编号。
(2) 将滤膜在水中浸泡 2 min。
(3) 将滤膜叠放在一起，两张滤膜间用直径为 85 mm 的 Whatman 3 MM 滤纸隔开。
(4) 将这一摞滤膜用铝箔包起来，于蒸汽锅（liquild cycle)中 15 psi (1.05 kg/cm2) 高压灭菌 15 min。
2. 将包装混合物、噬菌体原种或文库用 SM+ 明胶进行稀释。将稀释的噬菌体原种与适当量新鲜制备的铺平板细菌混合。感染细菌培养物 37℃ 温育 20 min。
3. 在每份感染细胞中加入 3 ml 或 6.5 ml 熔化的（47℃）顶层琼脂，混匀，倒入独立编号的 90 mm 或 150 mm 琼脂平板中。
4. 盖上平板，使顶层琼脂糖凝固，37℃ 倒置培养，直到噬菌斑出现，并刚刚开始相互接触（10~12 h)。
5. 将平板于 4℃ 至少放置 1 h, 使顶层琼脂糖凝固。
6. 将平板从冷库或冰箱中取出。用第一套标记滤膜影印每个平板的噬菌斑。将标记的干燥、圆形硝酸纤维素膜或尼龙膜放在顶层琼脂糖的表面，使其与噬菌斑直接接触。
7. 在滤膜的四周标记三个或更多个点，用 21 号注射针刺穿这几个点直至下面的琼脂，注入防水的黑绘图墨。
8. 1~2 min 后，用一个平端镊子（如 Milhpore 镊子）依次从每个平板上揭下滤膜。
噬菌体 DNA 在滤膜上的变性
9. 在自助食堂塑料盘中或 Pyrex 平皿中放入一张浸满变性液的 Whatman 3 MM 滤纸 ( 或相当型号），然后将滤膜转移至滤纸上，有噬菌斑的一面朝上，放置 1~5 min。
10. 将滤膜转移至浸满中和液的 Whatman 3 MM 滤纸上，有噬菌斑的一面朝上，放置 5 min。
将噬菌体 DNA 固定在滤膜上
11. 制备用于固定的滤膜。
通过微波或烘烤将 DNA 固定在滤膜上：若用微波炉，则直接按步骤 13 进行； 若在真空炉内烘烤，则将滤膜转移至一张 3 MM 的干滤纸上或一摞纸巾上。在室温滤膜至少干燥 30 min。
通过紫外交联将 DNA 固定在滤膜上：将滤膜置于一张浸泡了 2X SSPE 的 Whatman 3 MM 滤纸上，然后放在紫外交联仪的附近。
12. 如果需要，在第一套滤膜处理完后，用第二套滤膜进行噬菌斑影印。保证两套滤膜以相同位置放入平板。
13. 将 DNA 从噬菌斑固定至滤膜上
通过微波炉处理进行固定：将湿滤膜放在一张干 Whatman 3 MM 滤纸上，微波炉内以最大功率照射 2~3 min。
通过烘烤固定：将干滤膜（步骤 10）摞成一叠，两张滤膜间用干 Whatman 3 MM 滤纸隔开，在真空炉中 80℃ 烘烤 1 ~2 h。
通过紫外交联固定：用市售设备完成该项操作，按照厂家说明书进行。
14. 烘烤或交联后，将干滤膜用铝箔宽松地包起来，保存于室温。另外，若杂交在大约一天内进行，用 0.1X SSC 或 SSPE 和 0.5% SDS 65℃ 洗膜 30 min，湿润保存于封口塑料袋中。
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