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DNA实验

噬菌体DNA从噬菌斑到滤膜的转移实验

2024-05-21 DNA实验 加入收藏
原理一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法,在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法,包


原理

一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法,在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法,包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。

材料与仪器

λ 噬菌体文库 大肠杆菌铺平板细菌
变性液 中和液 SM+ 明胶 SSPE
LB 或 NZCYM 琼脂平板 LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖 交联设备 微波炉或真空炉 注射针和注射器 硝酸纤维素膜或尼龙膜 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

变性液

中和液

SM+ 明胶

2X SSPE

2. 培养基

LB 或 NZCYM 琼脂平板

LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖

3. 专用设备

交联设备(如 Stratgene 公司的 Stratalinker、Bio-Rad 公司的 GS gene Linker)、

微波炉或预置于 80℃ 的真空炉

注射针和注射器(21 号)

硝酸纤维素膜或尼龙膜

预置于 47℃ 和 65℃ 的水浴

防水的黑绘图墨(印度墨)

Whatman 3 MM 纸

Whatman 3 MM 滤纸(直径为 85 mm)

4. 载体和菌株

λ 噬菌体文库

大肠杆菌铺平板细菌

二、方法

滤膜的制备和噬菌斑的转印

1. 转印滤膜的制备:

(1) 用软铅笔或圆珠笔对干滤膜编号。

(2) 将滤膜在水中浸泡 2 min。

(3) 将滤膜叠放在一起,两张滤膜间用直径为 85 mm 的 Whatman 3 MM 滤纸隔开。

(4) 将这一摞滤膜用铝箔包起来,于蒸汽锅(liquild cycle)中 15 psi (1.05 kg/cm2) 高压灭菌 15 min。

2. 将包装混合物、噬菌体原种或文库用 SM+ 明胶进行稀释。将稀释的噬菌体原种与适当量新鲜制备的铺平板细菌混合。感染细菌培养物 37℃ 温育 20 min。



3. 在每份感染细胞中加入 3 ml 或 6.5 ml 熔化的(47℃)顶层琼脂,混匀,倒入独立编号的 90 mm 或 150 mm 琼脂平板中。

4. 盖上平板,使顶层琼脂糖凝固,37℃ 倒置培养,直到噬菌斑出现,并刚刚开始相互接触(10~12 h)。

5. 将平板于 4℃ 至少放置 1 h, 使顶层琼脂糖凝固。

6. 将平板从冷库或冰箱中取出。用第一套标记滤膜影印每个平板的噬菌斑。将标记的干燥、圆形硝酸纤维素膜或尼龙膜放在顶层琼脂糖的表面,使其与噬菌斑直接接触。

7. 在滤膜的四周标记三个或更多个点,用 21 号注射针刺穿这几个点直至下面的琼脂,注入防水的黑绘图墨。

8. 1~2 min 后,用一个平端镊子(如 Milhpore 镊子)依次从每个平板上揭下滤膜。

噬菌体 DNA 在滤膜上的变性

9. 在自助食堂塑料盘中或 Pyrex 平皿中放入一张浸满变性液的 Whatman 3 MM 滤纸 ( 或相当型号),然后将滤膜转移至滤纸上,有噬菌斑的一面朝上,放置 1~5 min。

10. 将滤膜转移至浸满中和液的 Whatman 3 MM 滤纸上,有噬菌斑的一面朝上,放置 5 min。

将噬菌体 DNA 固定在滤膜上

11. 制备用于固定的滤膜。

通过微波或烘烤将 DNA 固定在滤膜上:若用微波炉,则直接按步骤 13 进行; 若在真空炉内烘烤,则将滤膜转移至一张 3 MM 的干滤纸上或一摞纸巾上。在室温滤膜至少干燥 30 min。

通过紫外交联将 DNA 固定在滤膜上:将滤膜置于一张浸泡了 2X SSPE 的 Whatman 3 MM 滤纸上,然后放在紫外交联仪的附近。

12. 如果需要,在第一套滤膜处理完后,用第二套滤膜进行噬菌斑影印。保证两套滤膜以相同位置放入平板。

13. 将 DNA 从噬菌斑固定至滤膜上

通过微波炉处理进行固定:将湿滤膜放在一张干 Whatman 3 MM 滤纸上,微波炉内以最大功率照射 2~3 min。

通过烘烤固定:将干滤膜(步骤 10)摞成一叠,两张滤膜间用干 Whatman 3 MM 滤纸隔开,在真空炉中 80℃ 烘烤 1 ~2 h。

通过紫外交联固定:用市售设备完成该项操作,按照厂家说明书进行。

14. 烘烤或交联后,将干滤膜用铝箔宽松地包起来,保存于室温。另外,若杂交在大约一天内进行,用 0.1X SSC 或 SSPE 和 0.5% SDS 65℃ 洗膜 30 min,湿润保存于封口塑料袋中。




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