拟南芥基因的图位克隆技术

1 国内外研究现状

拟南芥（Arabidopsis thaliana ）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

从遗传学的观点来看，基因克隆 的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆 基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆 基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。

图1 图位克隆 所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等， 2002）

图位克隆 （map-based cloning）又称定位克隆 （positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆 一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

目前完成整个拟南芥的图位克隆 过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆 能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等， 2000）。在拟南芥中的图位克隆 ，在很大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。

实现基因图位克隆 的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆 基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（Wang等，2000）。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）（Lukowitz等， 2000； Choe等， 2002； Gonzalez-Guzman等， 2002）。

和单核苷酸多态性（SNPs）（Rafalski， 2002）。SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的SSLP标记；对SNPs标记的检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于不编码区域（Peters等， 2003）。最常见的用于检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等， 1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。