制备单链M13噬菌体DNA
材料与仪器大肠杆菌LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇巴斯德吸管 试管 离心机步骤1. 如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA，以
材料与仪器
大肠杆菌
LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇
巴斯德吸管 试管 离心机
LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇
巴斯德吸管 试管 离心机
步骤
1. 如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA，以0.5 ng 重组M13mp复制型DNA或5~10 ng 单链DNA转化40 μl 感受态大肠杆菌DH5αF'株，按热休克方案进行转化。
2. 转化细胞加0.2 ml大肠杆菌DH5αF'过夜培养物后，混匀于3 ml H顶层琼脂，倾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃过夜。
2. 转化细胞加0.2 ml大肠杆菌DH5αF'过夜培养物后，混匀于3 ml H顶层琼脂，倾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃过夜。
3. 大肠杆菌DH5αF'过夜培养物以2×TY培养液稀释100倍，分装于18 mm×150 mm 试管，每份1.5 ml。
4. 用无菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑，并置于上述每份培养物中，要注意确保琼脂块已玻转移。
5. 重复进行挑斑，在37℃生长细菌5~6 h。
6. 细菌培养物移至1.5 ml 微量离心管中，于4℃或室温高速离心5 min，上清移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中。
5. 重复进行挑斑，在37℃生长细菌5~6 h。
6. 细菌培养物移至1.5 ml 微量离心管中，于4℃或室温高速离心5 min，上清移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中。
7. 噬菌体上清加入200 μl M13 PEG溶液，混匀，于室温放置15 min，高速离心5 min，弃上清。
8. 高速离心30 s，并以头部已拉细的巴斯德吸管吸出残余液体。
9. 以100 μl TE重悬沉淀，加入100 μl 缓冲液平衡酚，旋涡混合器轻轻振荡15~20 s。
10. 于4℃或室温高速离心5 min，转移上上清水相于一个干净的微量离心管中。
11. 加入11 μl 3 mol/l pH5.2的乙酸钠和250 μl 100%乙醇，于-70℃冷冻20 min。
12. 4℃高速离心10 min，弃上清。
13. 加入100 μl 冰冷70%乙醇，微量离心，弃上清，重复此70%乙醇冼涤1次。
14. 在Speedvac真空旋转蒸犮器中干燥沉淀。
15. 沉淀重溶于20 μl 缓冲液，取0.5 μl 在小型凝胶中电泳，以确证DNA的浓度。
16. 剩余贮于-20℃直到用作模板进行测序反应。
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