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DNA实验

制备单链M13噬菌体DNA

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
材料与仪器大肠杆菌LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇巴斯德吸管 试管 离心机步骤1. 如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA,以


材料与仪器

大肠杆菌
LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇
巴斯德吸管 试管 离心机

步骤

1.  如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA,以0.5 ng 重组M13mp复制型DNA或5~10 ng 单链DNA转化40 μl  感受态大肠杆菌DH5αF'株,按热休克方案进行转化。

2.  转化细胞加0.2 ml大肠杆菌DH5αF'过夜培养物后,混匀于3 ml H顶层琼脂,倾倒于37℃平板,倒扣后置于37℃过夜。

3.  大肠杆菌DH5αF'过夜培养物以2×TY培养液稀释100倍,分装于18 mm×150 mm 试管,每份1.5 ml。
 
4.  用无菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑,并置于上述每份培养物中,要注意确保琼脂块已玻转移。

5.  重复进行挑斑,在37℃生长细菌5~6  h。

6.  细菌培养物移至1.5 ml 微量离心管中,于4℃或室温高速离心5 min,上清移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中。

7.  噬菌体上清加入200 μl M13 PEG溶液,混匀,于室温放置15 min,高速离心5 min,弃上清。

8.  高速离心30 s,并以头部已拉细的巴斯德吸管吸出残余液体。

9.  以100 μl TE重悬沉淀,加入100 μl 缓冲液平衡酚,旋涡混合器轻轻振荡15~20 s。

10.  于4℃或室温高速离心5 min,转移上上清水相于一个干净的微量离心管中。

11.  加入11 μl 3 mol/l pH5.2的乙酸钠和250 μl 100%乙醇,于-70℃冷冻20 min。

12.  4℃高速离心10 min,弃上清。

13.  加入100 μl 冰冷70%乙醇,微量离心,弃上清,重复此70%乙醇冼涤1次。

14.  在Speedvac真空旋转蒸犮器中干燥沉淀。

15.  沉淀重溶于20 μl 缓冲液,取0.5 μl 在小型凝胶中电泳,以确证DNA的浓度。

16.  剩余贮于-20℃直到用作模板进行测序反应。



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