小量裂解物中制备λ噬菌体DNA
材料与仪器重组λ噬菌体DNA酶Ⅰ RNA酶Ⅰ PEG SM SDS EDTA 异丙醇 乙酸钠 TE巴斯德吸管 试管 离心机步骤1. 在新鲜配制的λ顶层琼脂糖和
材料与仪器
重组λ噬菌体
DNA酶Ⅰ RNA酶Ⅰ PEG SM SDS EDTA 异丙醇 乙酸钠 TE
巴斯德吸管 试管 离心机
DNA酶Ⅰ RNA酶Ⅰ PEG SM SDS EDTA 异丙醇 乙酸钠 TE
巴斯德吸管 试管 离心机
步骤
1. 在新鲜配制的λ顶层琼脂糖和λ琼脂糖平板上，通过在平板上裂解适于λ噬菌体生长的大肠杆菌菌株，制备重组λ噬菌体毒种原液。
2. 取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。
3. 加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。
2. 取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。
3. 加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。
4. 4℃高速离心10 min，弃上清。再于4℃高速离心2 min，用拉细了的巴斯德吸管吸去残余上清。
5. 重悬噬菌体沉淀于500 μl SM 培养液，加入55 μl 10%SDS，0.5 μl 0.5 mol/l EDTA，轻轻混匀，于65 ℃保温15 min，不时轻轻摇匀溶解所有沉淀物。
6. 加入缓冲液平衡酚，用旋涡混合器剧烈振荡来抽提。
7. 室温高速离心2 min 将上层水相移入一个干净微量离心管中，重复用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重复用500 μl 氯仿抽提。
6. 加入缓冲液平衡酚，用旋涡混合器剧烈振荡来抽提。
7. 室温高速离心2 min 将上层水相移入一个干净微量离心管中，重复用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重复用500 μl 氯仿抽提。
8. 加入50 μl 3 mol/l pH7.0乙酸钠缓冲液，随后加入550 μl 异丙醇，于-20℃冰冻30 min。
9. 于4 ℃高速离心15 min，吸出并弃上清，晾干DNA沉淀。
10. 重悬沉淀于50 μl pH8.0的TE缓冲液。
10. 重悬沉淀于50 μl pH8.0的TE缓冲液。
11. 用于测序时，在碱溶液中变性0.1~0.3 pmol DNA（2~4 μg）。
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