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DNA实验

DNA 测序(鸟枪法)

2024-05-25 DNA实验 加入收藏
原理"鸟枪法"是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体


原理

"鸟枪法"是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段,继而将这些片段与适当的载体结合,将重组DNA转入受体菌扩增,获得无性繁殖的基因文库,再结合筛选方法,从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株,从中将重组的DNA分离、回收。
 
这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因,其特点是绕过直接分离基因的难关,在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上还得靠“碰运气”,所以人们称这个方法为鸟枪法或散弹枪实验法。
 
 

材料与仪器

步骤

一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA,并用Agarose凝胶电泳进行回收。
 
二、对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理,然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
 
三、进行Agarose电泳,切胶回收1kbp~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
 
四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中,然后转化,挑选克隆。
 
五、对阳性克隆(含1kbp~2kbpInsert)进行DNA测序。
 
六、对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。

常见问题

一、DNA测序量
 
应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率),对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。
 
如:对100kbp的DNA片段进行测序时,可以按以下方法进行计算:
 
6倍测序量=100 000 Bases x6/600 Bases=1 000个反应
 
8倍测序量=100 000 Bases x8/600 Bases=1 333个反应
 
二、结果编辑
 
按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序,然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段(Contig)。
 
三、补缺工作
 
结果编辑工作结束后,会发现在数个DNA大片段(Contig)间的序列没有测定,此时应该通过primer walking来测序,进行整体DNA序列的补缺工作。


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