P1噬菌体及其克隆系统的应用
原理P1 噬菌体与 λ 噬菌体同年被发现（Bertani 1951)。两种噬菌体在天然宿主中都是温和噬菌体，它们在实验室的研究历程也几乎相同。λ 噬菌体一经被发
原理
P1 噬菌体与 λ 噬菌体同年被发现（Bertani 1951)。两种噬菌体在天然宿主中都是温和噬菌体，它们在实验室的研究历程也几乎相同。λ 噬菌体一经被发现，立刻就被当时有影响的实验室选作分子水平研究溶原性噬菌体的模型。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 大肠杆菌菌株
乙醇 IPTG 异丙醇 酚 氯仿 聚乙二醇 醋酸钠 DNA 分离液 碱性裂解液 TE
脉冲场凝胶 LB 培养基 TB 培养基 Sorvall SS-34 转头或同类产品 Corex 离心管 65℃ 水浴箱
乙醇 IPTG 异丙醇 酚 氯仿 聚乙二醇 醋酸钠 DNA 分离液 碱性裂解液 TE
脉冲场凝胶 LB 培养基 TB 培养基 Sorvall SS-34 转头或同类产品 Corex 离心管 65℃ 水浴箱
步骤
一、材料
1. 缓冲液及溶液
醋酸铵（0.5 mol/L)
乙醇
IPTG ( 1 mmol/L)
异丙醇
MgCl2 (1 mmol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
聚乙二醇（40%, m/V，PEG8000 溶液）
醋酸钠（0.3 mol/L，pH 5.2)
DNA 分离液
碱性裂解液Ⅰ
碱性裂解液Ⅱ
碱性裂解液Ⅲ
TE ( pH 8.0 )
含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0)
2. 酶与缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
脉冲场凝胶（或 0.5% 琼脂糖凝胶）
4. 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基。
含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基。
5. 离心机与转头
Sorvall SS-34 转头或同类产品。
6. 专用设备
Corex 离心管（30 ml)
65℃ 水浴箱
7. 载体与菌株
用非重组 P1 噬菌体或 PAC 载体转化的大肠杆菌菌株（培养物）
用重组 P1 噬菌体或 PAC 载体转化的大肠杆菌菌株（培养物）。
二、方法
重组 P1 或 PAC DNA 的制备
1. 分别在两支 50 ml Falcon 试管或 Erlenmeyer 培养瓶中加入 10 ml 含有 25 μg/ml 卡那霉素的 TB。在一支试管中接种含有重组 P1 或 PAC 的单一菌落，另一支试管中则接种仅转化空载体的菌落，37℃ 剧烈振摇 12~16 h，使培养物达到饱和。
2. 将培养物转移到 15 ml 离心管中，4℃，3500 g ( Sorvall SS-34 转头，5400 r/min ) 离心 5 min, 收集细胞沉淀，用 3 ml 无菌水重新悬浮沉淀，再重复离心步骤。
3. 重悬沉淀于 2 ml 碱性裂解液Ⅰ中，并置于冰上。
4. 加入 3 ml 碱性裂解液Ⅱ，轻轻翻转离心管几次，混匀溶液，冰浴 10 min。
5. 向各管细胞悬液中加入 3 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ，轻轻翻转试管数次，混匀溶液，放置于冰上 10 min。
6. 4℃，12000 g （Sorvall SS-34 转头，10000 r/min）离心 10 min，沉淀细胞碎片。
7. 转移上清（约 7 ml ) 至 30 ml 的 Corex 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻翻转离心管数次以混匀溶液。4℃ 下，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 离心 10 min, 收集核酸沉淀。
8. 小心吸出上清，将离心管倒置于 Kimwipe 纸巾上，直至无液滴流出。用连接在真空泵的巴斯德吸管移去管壁上附着的液滴，加入 0.4 ml 0.3 mol/L 的乙酸钠（pH 5.2) 溶解核酸沉淀。65℃ 短暂加热几分钟，以助核酸溶解。
重组 P1 或 PAC DNA 的纯化
9. 转移 DNA 溶液至微量离心管。用等体积的酚：氯仿抽提一次。室温条件下，在微型离心机上以最大速度离心 5 min, 分离水相与有机相。离心结束后，转移上层水相至一新的微量离心管中。
10. 加入 1 ml 冰预冷的乙醇，翻转离心管数次以混匀溶液。4℃ 下以最大速度离心 10 min 沉淀 DNA。用 0.5 ml 70% 乙醇洗涤沉淀，4℃ 再离心 2 min。
11. 小心移去上清，倒置离心管，室温干燥至痕量乙醇挥发殆尽。向沉淀中加入 0.4 ml 含有 RNase 的 TE, 盖好离心管，置于 37℃。在接下来的 15 min 内，间歇轻摇离心管，以助 DNA 的溶解。继续温育至 2 h。
12. 加入 4 μl 1 mol/L 的 MgCl2 和 200 μl 40% 的 PEG 溶液，混匀，4℃ 下以最大速度离心 15 min，收集 DNA 沉淀。
13. 吸去上清。将沉淀重悬于 0.5 ml 0.5 mol/L 的醋酸铵中，加入 1 ml 乙醇，翻转离心管数次，混匀。4℃ 下以最大速度离心 15 min, 收集沉淀。
14. 再次吸去上清，用 0.5 ml 冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。倒置离心管，室温干燥至痕量乙醇挥发殆尽。重悬沉淀于 50 μl TE ( pH 8.0)。
15. 为进行限制酶分析，消化 5~15 μl ( 约 1 μg）重悬 DNA，用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳或脉冲场凝胶电泳分析产物。
1. 缓冲液及溶液
醋酸铵（0.5 mol/L)
乙醇
IPTG ( 1 mmol/L)
异丙醇
MgCl2 (1 mmol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
聚乙二醇（40%, m/V，PEG8000 溶液）
醋酸钠（0.3 mol/L，pH 5.2)
DNA 分离液
碱性裂解液Ⅰ
碱性裂解液Ⅱ
碱性裂解液Ⅲ
TE ( pH 8.0 )
含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0)
2. 酶与缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
脉冲场凝胶（或 0.5% 琼脂糖凝胶）
4. 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基。
含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基。
5. 离心机与转头
Sorvall SS-34 转头或同类产品。
6. 专用设备
Corex 离心管（30 ml)
65℃ 水浴箱
7. 载体与菌株
用非重组 P1 噬菌体或 PAC 载体转化的大肠杆菌菌株（培养物）
用重组 P1 噬菌体或 PAC 载体转化的大肠杆菌菌株（培养物）。
二、方法
重组 P1 或 PAC DNA 的制备
1. 分别在两支 50 ml Falcon 试管或 Erlenmeyer 培养瓶中加入 10 ml 含有 25 μg/ml 卡那霉素的 TB。在一支试管中接种含有重组 P1 或 PAC 的单一菌落，另一支试管中则接种仅转化空载体的菌落，37℃ 剧烈振摇 12~16 h，使培养物达到饱和。
2. 将培养物转移到 15 ml 离心管中，4℃，3500 g ( Sorvall SS-34 转头，5400 r/min ) 离心 5 min, 收集细胞沉淀，用 3 ml 无菌水重新悬浮沉淀，再重复离心步骤。
3. 重悬沉淀于 2 ml 碱性裂解液Ⅰ中，并置于冰上。
4. 加入 3 ml 碱性裂解液Ⅱ，轻轻翻转离心管几次，混匀溶液，冰浴 10 min。
5. 向各管细胞悬液中加入 3 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ，轻轻翻转试管数次，混匀溶液，放置于冰上 10 min。
6. 4℃，12000 g （Sorvall SS-34 转头，10000 r/min）离心 10 min，沉淀细胞碎片。
7. 转移上清（约 7 ml ) 至 30 ml 的 Corex 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻翻转离心管数次以混匀溶液。4℃ 下，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 离心 10 min, 收集核酸沉淀。
8. 小心吸出上清，将离心管倒置于 Kimwipe 纸巾上，直至无液滴流出。用连接在真空泵的巴斯德吸管移去管壁上附着的液滴，加入 0.4 ml 0.3 mol/L 的乙酸钠（pH 5.2) 溶解核酸沉淀。65℃ 短暂加热几分钟，以助核酸溶解。
重组 P1 或 PAC DNA 的纯化
9. 转移 DNA 溶液至微量离心管。用等体积的酚：氯仿抽提一次。室温条件下，在微型离心机上以最大速度离心 5 min, 分离水相与有机相。离心结束后，转移上层水相至一新的微量离心管中。
10. 加入 1 ml 冰预冷的乙醇，翻转离心管数次以混匀溶液。4℃ 下以最大速度离心 10 min 沉淀 DNA。用 0.5 ml 70% 乙醇洗涤沉淀，4℃ 再离心 2 min。
11. 小心移去上清，倒置离心管，室温干燥至痕量乙醇挥发殆尽。向沉淀中加入 0.4 ml 含有 RNase 的 TE, 盖好离心管，置于 37℃。在接下来的 15 min 内，间歇轻摇离心管，以助 DNA 的溶解。继续温育至 2 h。
12. 加入 4 μl 1 mol/L 的 MgCl2 和 200 μl 40% 的 PEG 溶液，混匀，4℃ 下以最大速度离心 15 min，收集 DNA 沉淀。
13. 吸去上清。将沉淀重悬于 0.5 ml 0.5 mol/L 的醋酸铵中，加入 1 ml 乙醇，翻转离心管数次，混匀。4℃ 下以最大速度离心 15 min, 收集沉淀。
14. 再次吸去上清，用 0.5 ml 冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。倒置离心管，室温干燥至痕量乙醇挥发殆尽。重悬沉淀于 50 μl TE ( pH 8.0)。
15. 为进行限制酶分析，消化 5~15 μl ( 约 1 μg）重悬 DNA，用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳或脉冲场凝胶电泳分析产物。
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