血基因组DNA大量试剂盒提取法

一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 

1.  说明书，耗材：DNA 制备管、中量滤器、连接管。
 

2.  Buffer VL：细胞和病毒裂解液，室温密闭贮存。
 

3.  Buffer G-B：蛋白沉淀液，室温密闭贮存。
 

4.  Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液。请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。
 

5.  Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。
 

6.  Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。
 

7.  Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
 

8.  Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

9.  Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备
 

1.  第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
 

2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
 

3.  制备Buffer DV：取4 ml Buffer DV-A 250 ml 异丙醇，150 ml 异丁醇，加入提供的500 ml 试剂瓶中，混合均匀。
 

4.  4℃预冷Buffer DV。
 

三、实验步骤

【DNA 释放 】
 

1. 将5 ml 抗凝全血置于一50 ml 离心管中，若全血样本体积不足5 ml，用PBS 补充至5 ml。
 

2. 加入10 ml Buffer VL，盖紧离心管帽，旋涡振荡1 min。
 

3. 加入10 ml Buffer G-B，再次盖紧离心管帽，立刻上下混匀。
 

【两相分离去除蛋白和其它杂质】
 

4. 加入20 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合均匀。≥5 000xg 离心5 min。
 

~undefined 请在实验前按照第一页准备Buffer DV。
 

5. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入20 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，≥5 000xg离心5min。
 

【基因组DNA 的纯化】
 

6. 丢弃上相，将下相转移至中量滤器中（滤器置于另一50 ml 离心管中），将活塞插入注射器，缓慢推动活塞，收集50 ml 离心管中的滤液。
 

~undefined 上相必须完全弃尽。
 

7. 弃滤器，在滤液中加入10 ml Buffer BV，混合均匀。
 

8. 将DNA 大量制备管插到负压装置的插口上，将步骤7 的混合液移到制备管中，开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱。
 

9. 待步骤8 管中液体都吸尽后，加入15 ml Buffer W1，吸尽管中液体，保持负压。
 

10. 加入20 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸尽管中液体，关闭负压装置。
 

~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
 

11. 将大量制备管从负压装置转移至另一洁净的50 ml 离心管中，≥6 000xg 离心5 min。
 

12. 将大量制备管插回到负压装置的插口上，保持负压5 min，吸尽残存的Buffer W2。
 

13. 将大量制备管置于另一洁净的50 ml 离心管中，在silica 膜中央加1.5 ml Eluent 或去离子水，室温静置5 min，≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。
 

~undefined 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
 

14. 可选步骤：同样方法，在silica 膜中央加0.75 ml Eluent 或去离子水，室温静置1 min，≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。

1.  下列操作步骤适合从5 ml 的抗凝人或哺乳动物全血，或500 ul 抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至250ug 的基因组DNA。
 

2.  Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
 

3.  在按照此说明书操作前，请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作，按照正确方法处理体液和感染体。
 

4.  操作时严格按操作步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，并高压灭菌。