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DNA实验

mRNA 的细胞内注射实验

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
材料与仪器步骤一、用于细胞内注射的加帽 mRNA 的制备材料步骤1.依次加入下列物质,终体积为 20ul,冰上操作:2.37℃ 温育 lh。3.加入 Iul D


材料与仪器

步骤

一、用于细胞内注射的加帽 mRNA 的制备

材料

—T3 或 T 7 RNA 聚 合 酶 ( Promega) —线性DNA 一5 X Cap-Scribe缓 冲 液 ( Boehringer Mannheim)。缓冲液内核糖核昔_二鱗酸和加 帽-核苷酸( P1J '- (7-甲基) -鸟 苷 P3 5'鸟苷三磷酸)的浓度经过优化,以确保高效合 成加帽mRNA HRNaid-试 剂 盒 (Bio 101) 〜RNA酶 抑 制 剂 ( Promega; 40 U/fxl) 〜脱氧核糖核酸酶I (Gibco-BRL; IU/V1)

步骤

1.依次加入下列物质,终体积为 20ul,冰上操作:

2.37℃ 温育 lh。

3.加入 Iul DNA 酶 I(无 RNA 酶),37℃ 温育 10 min。

4.用 RNaid 试剂盒提纯 mRNA。

5.25ul 灭菌水(无 RNA 酶)溶解 RNA。

二、注射的准备

材料


溶液

(未提到的溶液,可以参见方法 1「培养神经元的原位杂交」相关部分)

步骤

1.从中枢神经系统分离神经元,保持其一长段轴突的完整。

2.在条件培养基中培养 i8~48 h, 直到从原有的轴突长出足够的突起。

3.用锋利的玻璃电极,从距离胞体大约一个细胞直径的部位横切轴突。

4.用微量加样器给玻璃电极充灌 mRNA(质量浓度 2 〇?50ng/pd)。仅使电极头部充满 mRNA 溶液(每个电极大约用 0.3ul)。

5.穿刺轴突,以 20psi、持续 1~15S 脉冲将 mRNA 注射入轴突。在相差显微镜下可观察到白色小滴状的 mRNA。

6.温育。温育时间根据细胞类型和所用 mRNA 种类而定。在我们的实验中,应用椎实螺属编码卵生激素前体的 mRNA,—般注射后温育 2 h 可以检测到其转化的蛋白。

7.固定并透膜处理细胞,按培养神经元:ISH 方法中第 1-3 步进行。

8.TBSGT 洗涤 2 次,每次 5 min。

9.与一抗温育、室温 2 h 或 4℃ 过夜。

10.TBSGT 洗涤 2 次,每次 10 min。

11.与二抗温育,室温 1~2 h。我们的实验应用 FITC 交联的二抗,也可用酶交联抗体。用碱性磷酸酶交联二抗的步骤可参见方法 i「培养神经元的原位杂交’

12.TBSGT 缓冲液洗涤丄次,5 min.

13.水洗涤 2 次,每次 I0 min。

14.75% 甘油(溶于水)封片,甘油溶液中含 0.5% 乙二胺,以减慢 FITC 的褪色。

15.倒置荧光显微镜观察。

三、结果

为研究离体轴突中的 mRNA 是否能转化成蛋白质,我们将编码卵生激素(ELH) 前体的 mRNA 注入 PedalA 细胞的轴突。我们首先证实这些细胞不表达 ELH 基因。然后通过免疫细胞化学方法用 ELH 的抗血清检测注射 mRNA 的翻译。结果显示,离体轴突能够将注射的 mRNA 转化成通过免疫细胞化学方法可检测到的蛋白质。转化产物主要定位于生长锥和曲张体(图 3-7)。


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