基因置换实验（质粒改组）

酵母菌株7-2 2404 质粒pDB141 pRG68
诱变的pDB141 DNA
YPD 平板 HC-leu平板 5-FOA平板

第 1 天

将菌株 7-2 在 YPD 平板上划线，30°C 培养。

第 3 天

挑一个丰满的菌株 7_2 菌落，接种到 5 mlYPD 培养液，30°C 下培养过夜。

第 4 天

使用血球计数板（附录 G，用标准血球计数板进行酵母细胞计数）测定 5 ml 菌株 7-2 培养物的细胞密度。用 50 mlYPD 培养液将细胞稀释至 5X106 个/ml，置 30°C 培养细胞到两次分裂（约 4 h)。按照「技术和方案 1，酵母的高效转化」收获细胞，用 lOOng 诱变的 PDB141 质粒进行转化（提供的母液用技术和方案 7, 质粒 DNA 的羟胺突变或经 XL-1 红色菌株细胞诱变制得）。必须包括一个不加 DNA 的阴性对照。这里将对「技术和方案 1，酵母的高效转化」有一个小的改进。改进步骤 16: 用已灭菌的蒸馏水 2.5 ml 重悬转化细胞（浓缩的细胞）。吸出 0.4 ml 浓缩的细胞稀释到 2.0 ml(稀释的细胞）。取 0.2 ml 涂 HC-ieu 平板，用浓缩的细胞悬液涂 10 个板，用稀释的细胞涂另外 10 个板。把0.2 ml 不加 DNA 的阴性对照的浓缩细胞涂在一个平板上。所有 21 个平板在 23°C 下培养。

第 9 天

选择 10 个转化平板，理想情况下，每个平板有 100~300 个菌落，计算菌落总数。

把 10 个 HC-leu 转化平板分别影印到 5-FOA 平板上。保留主要的平板（HC-leu)，23°C 下培养。

第 11 天

测定在 FOA 抑制下无法生长的菌落片段。把 FOA 平板分别影印到两块 YPD 平板和一块含有 15jug/ml 苯的 YPD 平板。一块 YPD 平板于 37°C 下培养，另一块 YPD 平板和 YPD+苯平板于 23°C 下培养。

第 12 天

统计 37°C 下影印平板的温度敏感型候选菌落。从 23°C 下培养的 YPD 平板上挑 12 个温度敏感型候选菌落，划线到 YPD 平板于 23°C 下培养纯化（最多使用 3 块 YPD 平板)。

第 13 天

统计 23°C 下培养的含苯平板的苯敏感和无法生长或生长不好的菌落。挑 12 个候选菌落，划线到 YPD 平板于 23°C 下培养纯化（最多使用 3 块 YPD 平板）。注意任何既是苯敏感也是温度敏感的菌落。

第 16 天

实验七基因置换?59?

在 YPD+苯平板和两块 YPD 平板上分别再次测定纯化的候选菌落的苯敏感性和温度敏感性。一块 YPD 平板于 23°C 下培养，另一块于 37°C 下培养。

第 17 天

统计 37°C 下培养平板上的温度敏感型菌落。统计 23°C 下培养的含苯平板上的菌落，将平板保存至第 2 天。

第 18 天

统计含苯平板上的菌落，测定每种突变体的频率。