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DNA实验

随机引物法(在融化琼脂糖存在下利用随机寡核苷酸延伸进行DNA的放射标记)

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
原理此法系可用于从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DNA 的放射性标记 ( Feinberg 和 Vogelstein 1983,1984)。材料与仪器大肠杆菌 DNA


原理

此法系可用于从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DNA 的放射性标记 ( Feinberg 和 Vogelstein 1983,1984)。

材料与仪器

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段 模板 DNA
醋酸氨 牛血清白蛋白 乙醇 溴化乙啶 NA 终止 贮存缓冲液 随机引物缓冲液
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶 沸水浴 Sephadex G-50 离心柱

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸氨(10 mol/L)

牛血清白蛋白(10 mg/ml)

乙醇

溴化乙啶(10 mg/ml)或 SYBR Gold 染液

NA 终止/贮存缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),50 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA (pH8.0),0.5% (m/V) SDS)

5X 随机引物缓冲液(250 mmol/L Tris (pH 8.0),25 mmol/L MgCl2,20 mmol/L DTT,未标记的 dNTP 各 2 mmol/L,1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至pH 6.6),1 mg/ml 长度为 6 个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物)

2. 酶和缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝胶

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物(125 ng/μl TE,pH 7.6 )

模板 DNA

5. 放射性复合物

[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性 >3000 Ci/mmol)

6. 专用设备

沸水浴

Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 电泳后用溴化乙锭(终浓度 0.5 μg/ml)或 SYBR Gold 染胶,切下所需条带,尽可能切去多余的凝胶。

2. 将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中,称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水 3 ml。

3. 将微量离心管放在沸水浴中煮 7 min 以使凝胶融化,同时也使 DNA 变性。

如立即进行标记,可将离心管置于 37℃,直至需要加入模板;否则可贮存于 -20℃。但每次从 -20℃ 取出后,含 DNA 的凝胶团要在 100℃ 加热 3~5 min,然后置于 37℃ 直至放射性标记反应开始。

4. 将一个新的微量离心管置于 37℃ 水浴或加热板上,按下列次序加入:

5X 寡核苷酸标记缓冲液            10 μl

10 mg/ml 牛血清白蛋白溶液      2 μl

DNA ( 体积不超过 32 μl)         20~50 ng

10 mCi/ml [α-32P] dNTP           5 μl

( 比活性 >3000 Ci/mmol)

Klenow 片段(5 单位)            1 μl

水                                           加至 50 μl

用微量加样器彻底混合各组分,于室温温育 2~3 h 或 37℃ 温育 60 min。

5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液,可根据需要进行以下步骤。

贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。



通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入,可不进行该步骤。





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