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DNA实验

随机引物法(利用寡核苷酸延伸法标记DNA放射性)

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
原理利用寡核苷酸作引物,DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成(Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一,它们就可在模板的多位点上与模板杂


原理

利用寡核苷酸作引物,DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成(Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一,它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸(5' 端的核苷酸除外)的互补物将以同样的频率掺入产物。

材料与仪器

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段 随机脱氧核苷酸引物 模板 DNA
醋酸氨 乙醇 NA 终止 贮存缓冲液 随机引物缓冲液 dNTP 溶液
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶 沸水浴或加热板 微量离心管 SephadexG-50 离心柱

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸氨(10 mol/L)

乙醇

NA 终止/贮存缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),50 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA (pH 8.0),0.5% (m/V) SDS)

5X 随机引物缓冲液(250 mmol/L Tris (pH 8.0),25 mmol/L MgCl2,100 mmol/L NaCl,10 mmol/L 二琉苏糖醇(DTT),1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6),1 mol/L DTT 贮存于 -20℃,临用前用水稀释,使用后弃去稀释的 DTT。)

2. 酶和缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝胶

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

含三种未标记的 dNTP 溶液(各 5 mmol/L)

长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物(125 ng/μl TE,pH 7.6)

模板 DNA ( 5~25 ng/μl TE,pH 7.6)

5. 放射性复合物

[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性 >3000 Ci/mmol)

6. 专用设备

预热至 95℃ 的沸水浴或加热板

微量离心管(0.5 ml )

SephadexG-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一个 0.5 ml 的微量离心管中加入溶于 30 μl 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 μl 随机脱氧核苷酸引物(约 125 ng)。盖紧微量离心管,置于沸水浴中 2 min。

2. 将微量离心管移至冰上放置 1 min,4℃ 下离心 10s 使引物与模板的混合物沉降至管底,将微量离心管重新置于冰上。

3. 在引物与模板的混合物中加入:

5 mmol/L dNTP 溶液       1 μl

5X 随机引物缓冲液         10 μl 

10 mCi/ml [α-32P] dNTP  5 μl

( 比活性 3000 Ci/mmol)

水                                   加至 50 μl

4. 加入 5 单位(约 1 μl)的 Klenow 片段,轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应 60 min。

5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液,可根据需要进行以下步骤。

贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。



通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入,可不进行该步骤。


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