用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因实验
材料与仪器带有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的适于转化的大肠杆菌菌株 IPTG 诱导的表达载体考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶 加
材料与仪器
带有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的适于转化的大肠杆菌菌株 IPTG 诱导的表达载体
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶 加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 LB 琼脂平板 LB 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴 振荡培养箝
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶 加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 LB 琼脂平板 LB 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴 振荡培养箝
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培养基
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 琼脂平板
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
振荡培养箝
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
带有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的适于转化的大肠杆菌菌株
带有 lacIq 等位基因的 IPTG 诱导表达质粒（如 PMAL 和 pGEX) 可以转化实验室的任何大肠杆菌菌株 (如 JM101,DH5F‘和 TG1)。详细内容参见本方案。
IPTG 诱导的表达载体
其他载体包括 pGEM-3Z(Promega 公司，见图 15-4)，pGEX-1（Pharmacia 公司），pKK223-3 (Pharmacia 公司）， pMEX (U.S.Biochemicals 公司），pTrc99A (Pharmacia 公司）和 pMAL (NewEnglandBiolabs 公司）。
阳性对照质粒（表达已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 诱导载体）
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5'端和 3'端带有与 IPTG 诱导表达载体对应的限制酶位点。
大多数 IPTG 诱导表达载体都含有表达外源蛋白所必需的全部控制元件。RCR 修饰表达 cDNA/基因，使结构两侧没有无关序列。为方便表达，可以根据所用载体和初步结果. 在片段末端加入其他调控序列（参见本方案疑难解析和诱导启动子表达蛋白的优化)。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 含靶 CDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 重组质粒转化有 lacIq 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有 lacI 基因，可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒（阴性对照）和阳性对照质粒转化相间的大肠杆菌菌株。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插人片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体，
5. 对照菌和重组菌分別挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，适当温度（20~37°C) 培养过夜。
大肠杆菌在室温的生长速度比在 37°C 慢 4 倍，所以~20°C 培养过夜（~16 h) 可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。请参见本章前言不溶性蛋白的处理部分。
6. 取 50ul 过夜培养物接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，20~37°C 振荡培养 2 h 以上，至对数中期（A550=0.5~1.0)。
7. 吸出 1ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，20~37°C 继续通气培养（参见下面 IPTG 浓度和诱导温度的优化）。
IPTG 的浓度对表达水平影响非常大。1mmol/L 只是一个起点，也是一个比较离的浓度。实验中, 应在 0.01~5.0 mmol/L 的范围内改变 IPTG 浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录, 才不致于使细菌的生物合成系统过载。
影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长溫度，通过实验确定最佳温度. 是表达外源蛋白的关键。虽然在 15~42°C 之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳溫度范围则可能很窄，只有 2~4°C。温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括：细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基（血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌 SOS 修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可靠的，必须进行反复的实验。
9. 在诱导的不同时间（如 1、2、4 和 6 h) 取 1ml 样品放于微量离心管中，测定 A550, 室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1 min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（请见附录 8)。
37°C 诱导 30 min 的阳性对照，有一条分子质量为 26kDa 的谷胱甘肽转移酶（GST) 带，GST 的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于 GST 对照。
大量表达靶蛋白
14. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 20~37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄（50 ug/ml) 的 LB 培养液，在 2L 摇瓶中于 20~37°C 振荡培养过夜，至对数中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案：
• 如果表达的是 GST 融合蛋白，继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培养基
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 琼脂平板
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
振荡培养箝
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
带有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的适于转化的大肠杆菌菌株
带有 lacIq 等位基因的 IPTG 诱导表达质粒（如 PMAL 和 pGEX) 可以转化实验室的任何大肠杆菌菌株 (如 JM101,DH5F‘和 TG1)。详细内容参见本方案。
IPTG 诱导的表达载体
其他载体包括 pGEM-3Z(Promega 公司，见图 15-4)，pGEX-1（Pharmacia 公司），pKK223-3 (Pharmacia 公司）， pMEX (U.S.Biochemicals 公司），pTrc99A (Pharmacia 公司）和 pMAL (NewEnglandBiolabs 公司）。
阳性对照质粒（表达已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 诱导载体）
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5'端和 3'端带有与 IPTG 诱导表达载体对应的限制酶位点。
大多数 IPTG 诱导表达载体都含有表达外源蛋白所必需的全部控制元件。RCR 修饰表达 cDNA/基因，使结构两侧没有无关序列。为方便表达，可以根据所用载体和初步结果. 在片段末端加入其他调控序列（参见本方案疑难解析和诱导启动子表达蛋白的优化)。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 含靶 CDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 重组质粒转化有 lacIq 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有 lacI 基因，可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒（阴性对照）和阳性对照质粒转化相间的大肠杆菌菌株。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插人片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体，
5. 对照菌和重组菌分別挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，适当温度（20~37°C) 培养过夜。
大肠杆菌在室温的生长速度比在 37°C 慢 4 倍，所以~20°C 培养过夜（~16 h) 可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。请参见本章前言不溶性蛋白的处理部分。
6. 取 50ul 过夜培养物接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，20~37°C 振荡培养 2 h 以上，至对数中期（A550=0.5~1.0)。
7. 吸出 1ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，20~37°C 继续通气培养（参见下面 IPTG 浓度和诱导温度的优化）。
IPTG 的浓度对表达水平影响非常大。1mmol/L 只是一个起点，也是一个比较离的浓度。实验中, 应在 0.01~5.0 mmol/L 的范围内改变 IPTG 浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录, 才不致于使细菌的生物合成系统过载。
影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长溫度，通过实验确定最佳温度. 是表达外源蛋白的关键。虽然在 15~42°C 之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳溫度范围则可能很窄，只有 2~4°C。温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括：细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基（血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌 SOS 修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可靠的，必须进行反复的实验。
9. 在诱导的不同时间（如 1、2、4 和 6 h) 取 1ml 样品放于微量离心管中，测定 A550, 室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1 min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（请见附录 8)。
37°C 诱导 30 min 的阳性对照，有一条分子质量为 26kDa 的谷胱甘肽转移酶（GST) 带，GST 的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于 GST 对照。
大量表达靶蛋白
14. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 20~37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄（50 ug/ml) 的 LB 培养液，在 2L 摇瓶中于 20~37°C 振荡培养过夜，至对数中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案：
• 如果表达的是 GST 融合蛋白，继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7
