用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因实验
材料与仪器大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3) pET 载体或同类载体 阳性对照质粒考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶
材料与仪器
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3) pET 载体或同类载体 阳性对照质粒
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 NZCYM 琼脂平板 NZCYM 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 NZCYM 琼脂平板 NZCYM 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1xSDS加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或cDNA片段
培养基
含氨苄（50ug/ml）的 NZCYM 琼脂平板
含氮苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)
pET 载体或同类载体
此系列载体请査阅 Novagen 公司目录（或网址 www.novagen.com)。
阳性对照质粒（如表达已知大小融合蛋白的 T7 噬菌体载体)
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5' 端和 3' 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒（如 pET 载体；Studier et al.1990) 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3）。将转化体铺于含氨苄 (50ug/ml) 的 NZCYM 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ng/ml) 的 NZCYM 培养液，37°C 培养过夜至饱和。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养 2 h。
7. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mnol/L，20~37°C 继续通气培养。
有些系统的 T7 噬菌体 RNA 聚合酶的表达受热诱导的启动子调控，而不是 IPTG 诱导的启动子。影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
9. 在诱导的不同时间（如 0.5、1、2 和 3 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A550，室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录 8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞，蛋白带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。
大量表达靶蛋白
14. 挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 2L 摇瓶中于 37°C 振荡培养至对数中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 从转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案：
• 如果表达的是 GST 融合蛋白，继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1xSDS加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或cDNA片段
培养基
含氨苄（50ug/ml）的 NZCYM 琼脂平板
含氮苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)
pET 载体或同类载体
此系列载体请査阅 Novagen 公司目录（或网址 www.novagen.com)。
阳性对照质粒（如表达已知大小融合蛋白的 T7 噬菌体载体)
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5' 端和 3' 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒（如 pET 载体；Studier et al.1990) 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3）。将转化体铺于含氨苄 (50ug/ml) 的 NZCYM 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ng/ml) 的 NZCYM 培养液，37°C 培养过夜至饱和。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养 2 h。
7. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mnol/L，20~37°C 继续通气培养。
有些系统的 T7 噬菌体 RNA 聚合酶的表达受热诱导的启动子调控，而不是 IPTG 诱导的启动子。影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
9. 在诱导的不同时间（如 0.5、1、2 和 3 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A550，室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录 8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞，蛋白带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。
大量表达靶蛋白
14. 挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 NZCYM 培养液，在 2L 摇瓶中于 37°C 振荡培养至对数中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 从转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案：
• 如果表达的是 GST 融合蛋白，继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7
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