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DNA实验

Southern 印迹实验(电转印法)

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
原理因为聚丙烯酰胺凝胶的扎径太小,DNA不能在其横截面上有效地扩散,毛细管转移法不适用DNA从聚丙烯酰胺凝胶的转移。因此,聚丙烯酰胺凝晈必须在低离子强度的缓冲液


原理

因为聚丙烯酰胺凝胶的扎径太小,DNA不能在其横截面上有效地扩散,毛细管转移法不适用DNA从聚丙烯酰胺凝胶的转移。因此,聚丙烯酰胺凝晈必须在低离子强度的缓冲液中用电转移法进行印迹。

材料与仪器

DNA
TBE
Scotch-Brite垫 Whatman滤纸

步骤

1.  在非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳DNA样品。
 
2.  电泳将近结束时,将一张大小足以覆盖凝胶中相应部分的尼龙膜漂浮于蒸馏水表面,然后浸入水中泡5 min。
 
3.  从电泳装置中取去一块玻璃板,染色后对凝胶进行照相(如果是非变性胶)在凝胶的表面铺一张Whatman 3 MM 滤纸,排去其间的所有气泡。

4.  揭起滤纸将凝胶剥离玻璃板。
 
5.  将2块Scotch-Brite垫浸泡于0.5XTBE电泳缓冲液中,反复挤压和振动除去气泡。

6.  裁7张与凝胶大小相等的Whatman 3 MM 滤纸,浸于0. 5×TBE电泳缓冲液中15~30 min。

7.  将一块饱和过的Scotch-Brite垫置于凝胶容器中灰色嵌板的内表面,将3张浸湿的滤纸置于其上,一次放一张,排去其间的气泡。

8.  将贴着凝胶的滤纸用0.5×TBE浸没,置于上述滤纸层之上4将凝胶的表面用0.5xTBE浸没,将预先浸湿的膜置于凝胶之上。
 
9.  用0.5xTBE浸没膜的表面,将剩余旳4张饱和过的Whatman 3 MM 滤纸置于其上。

10.  再加上另一块饱和过的Scotch-Brite垫,关上凝胶容器。
 
11.  用0.5xTBE半充满下Tras-Blot电转印室,将凝胶容器置于其中,使灰色嵌板面向阳极。

12.  加入0.5xTBE充满转印室,打开冷却装置,在30 V 下进行电转印。
 
13.  取下膜,用铅笔作好标记或切去一角标示膜的方向。

14.  从非变性凝胶转印的膜要进行变性,DNA面朝上,凝胶在3张用0.4 mol/l NaOH 浸泡过的Whatman 3 MM 滤纸之上放置10min。

15.  用2xSSC漂洗膜,置于一张Whatman 3 MM 滤纸上晾干,固定其DNA。将膜保存于室温。


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