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DNA实验

亚硫酸氢盐修饰后测序法检测甲基化(DNA甲基化)

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
原理重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,用PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需


原理

重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,用PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点的甲基化状态。

材料与仪器

DNA
NaOH 苯二酚(氢醌) 亚硫酸氢钠 石蜡油
离心管 恒温水浴锅 铝箔纸

步骤

1.将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;
 
2.加5.5ul新鲜配制的3M NaOH; 
 
3. 42℃水浴30min;
 
水浴期间配制:
 
4.10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)
 
5. 3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
 
6.EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。 
 
7.加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。
 
8.50℃避光水浴16h。

注意事项

避免化学品或外源DNA的污染。

常见问题

甲基化是目前的研究热点,就我所做的一点工作并其中一点心得,与大家分享。希望能够对大家有所帮助。


第一部分 基因组DNA的提取。


这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。


此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。


使用两者的细节:


1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;


2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。


验证提取DNA的纯度的方法有二:


1:紫外分光光度计计算OD比值;


2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。


我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。


第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA


如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。


1:将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;


2:加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;


3: 42℃水浴30min;


水浴期间配制:


4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)


5: 3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。


6:EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。


7:加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。


8:50℃避光水浴16h。


一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适。


这一步细节:


1:基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。


2:所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。


3:亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。


4:水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。


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