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DNA实验

质粒的制备(构建载体)

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
原理在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐


原理

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

材料与仪器

大肠杆菌菌液
LA培养基 LB培养基 75%乙醇
摇床 离心机 超净台 TE

步骤

1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养;


2.用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有Amp抗生素的LB培养基中,37℃摇床——250 r/min过夜培养;


3.吸取1.5 ml菌液,12000 g离心2分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净;


4.加入300 ml溶液 I振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块);


5.加入300 ml溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟;


6.加入300 ml溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;


7.12000 g离心10分钟;


8.吸取800 ml上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;


9.12000 g 常温离心15分钟;


10.倒尽上清,加75%乙醇浸洗除盐(放置片刻或离心3分钟后倒去上清);


11.室温放置或超净台上风干DNA;


12.加40 ml灭菌超纯水或TE溶解;


13.质粒、BAC的质量检测,于-20℃保存。

注意事项

小量制备的质粒DNA经酚/氯仿抽提后可以进行限制性内切酶分析 , 但是对于一些 DNA 纯化要求高的实验如哺乳动物细胞转染、转基因动物操作等, 需要进一步提高质粒DNA的纯度。这种纯度要求不但包括细菌染色体DNA 、RNA 及蛋白质的去除 ,而且还要选择质粒 DNA 的不同分子构型,一般为纯化共价闭环质粒 DNA 。常用方法如下:


①聚乙二醇沉淀法 ;


②氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法:多年来仍是提供毫克级高纯度质粒 DNA的基本方法, 该方法需要使用溴化乙锭和较长时间超速离心 ,它能制备大量质粒 DNA ,但比较昂贵和费时 ;


③Sepharose C L-4B 和 Bio-Gel A-150 m 层析法 ;


④NaCl 超速离心法 。

常见问题

附注:质粒检测


电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型


吸光值检测:采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值,若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间,说明质粒质量较好,1.8为最佳,低于1.8说明有蛋白质污染,大于1.8说明有RNA污染。


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