质粒的制备（构建载体）

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；

2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床——250 r/min过夜培养；

3.吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4.加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；

5.加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6.加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7.12000 g离心10分钟；

8.吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9.12000 g 常温离心15分钟；

10.倒尽上清，加75%乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11.室温放置或超净台上风干DNA；

12.加40 ml灭菌超纯水或TE溶解；

13.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

①聚乙二醇沉淀法 ;

②氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法：多年来仍是提供毫克级高纯度质粒 DNA的基本方法， 该方法需要使用溴化乙锭和较长时间超速离心 ,它能制备大量质粒 DNA ,但比较昂贵和费时 ;

③Sepharose C L-4B 和 Bio-Gel A-150 m 层析法 ;

④NaCl 超速离心法 。

附注：质粒检测

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。