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DNA实验

荧光原位杂交实验基本方案

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
材料与仪器样品DNA探针 非同位素 甲酰胺 杂交混合液 甲酰胺 Triton X-100 SSC相差显微镜 盖玻片 水浴锅 加湿盒 滤光片 荧光显微镜步骤1a.


材料与仪器

样品
DNA探针 非同位素 甲酰胺 杂交混合液 甲酰胺 Triton X-100 SSC
相差显微镜 盖玻片 水浴锅 加湿盒 滤光片 荧光显微镜

步骤

1a.  石蜡切片或细胞的杂交:按石蜡切片或细胞的原位杂交实验的基本方案步骤1~7,对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干(或在干燥器中干燥),随后贮于加有干燥剂的载玻片盒中,置-70℃过夜。
 
1b.  冰冻切片的杂交:按冰冻切片的原位杂交实验的备择方案步骤1~7,进行切片的预处理和乙酰化处理, 随后进行切片的脱水。
 
2.  对每一杂交实验,可用乙醇沉淀10~15 ng 探针,重溶于10 ml 去离子的甲酰胺中,加5 ug(0.5 ul)超声处理的鲑精DNA,在70~80℃温度下热变性探针10 min。

3.  加10 ul 主杂交混合液于变性探针中(探针终浓度为0.1~0.5 ug/ul 混匀),微量离心机以高速稍加离心,然后加于载玻片上。覆加22 mm2 盖玻片,轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中,在37℃温育2~4 h。

4.  杂交最后30 min 期间,以37℃水浴,在Coplin 广口瓶中,预热50 ml 50%甲酰胺/2xSSC洗液和50 ml 2xSSC。
 
5.  从加湿盒中取出载玻片,剥去橡皮泥(如有使用的话)并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2xSSC中,清冼杂交过的玻片15 min;接着以37℃ 2xSSC洗15 min;再于室温以1xSSC洗15 min。
 
6.  玻片在室温下,以4xSSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液,在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。

7.  加50 ul 生物素检测液,地髙辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2 的Parafilm 膜覆盖,放在一用铝箔包裹的加湿盒中,于37℃温育45 min。

8.  室温下,按顺序在裹以铝箔的Coplin 广口瓶中,分别用4xSSC、0.1%Triton X-100/4xSSC和4xSSC浸洗切片。毎种溶液中浸洗10 min。

9.  加50 ul DAPI 或碘化丙锭染色液于切片上,以一块22 mm2 的Parafilm 膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1xSSC的Coplin 广口瓶中快速浸洗,以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。
 
10.  加7 ul 适当的防褪色固片介质于已染色的切片上,覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质,注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片,放在有干燥剂的玻片盒中,贮于-20℃。
 
11.  用具落射光源,以及有适合实验中所用荧光染料的滤光片的荧光显微镜,观察实验结果。

12.  用Ektar-1000或Ektachrome-400彩色感光片照相。


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