ULS 标记实验基本方案

Universal Linkage System(ULS®;KREATECH Biotechnology BV）是用铂染色络合物与鸟嘌呤核苷的N7残基反应进行标记的方法。反应使核酸与铂荧光基团之间形成稳定的化学键。依据反应条件，ULS化合物在较低的程度上也与腺嘌呤形成络合物。该方法已用于DNA(包括质粒，黏粒，分子质量参考物，在低熔点琼脂糖中的DNA、BAC、PAC、YAC，全染色体文库，DOP-PCR产物，如卫星、着丝粒和端粒DNA的高度重复序列）、RNA、PNA、寡聚核苷酸和扩增的核酸产物。在Molecular Probes公司（Eugene，OR)同样提供ULS试剂和试剂盒。

用任何ULS化合物进行标记的模板大小必须小于1000bp。大于1000bp的模板通常会产生大量的点状背景。PCR产物一般小于1000bp，因此可直接进行标记。下面将要阐述的两种DNA破碎方法—超声破碎和酶切均可以用于Kreatech和Molecular Probes的操作步骤。Molecular Probes用Alexa—ULS拭剂时推荐用另一DNA酶I操作程序。操作步骤和相应的试剂是Molecular Probes提供的ULS标记试剂盒的一部分.

1DNA破碎

1.1超声破碎

1.用TE制备DNA溶液（20ng/μL)，最好用至少100μLDNA溶液进行超声破碎。

2.将样品放在冰上，用一个小的锥形底塑料管进行3个循环、每次循环1min的超声破碎DNA。选择超声破碎仪的功率水平和工作循环数，尽量使用最高的功率、尽量少的空泡形成。在破碎前和每个循环之后均将DNA溶液放在冰上1min预冷。在第二个和第三个循环前用微型离心机的最高转速离心DNA溶液5s，使全部溶液落至管底。

3.取部分DNA溶液在1%的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA大小是否合适。

4.开始进行标记程序。

1.2DNA酶处理

1.制备DNA酶I的储存液：用1mL 5mmol/L乙酸钠、1mmol/LCaCl2、50%甘油pH5.2溶解1mgDNA酶I(大约2000U/mg，Roche公司)。在加冻干的DNA酶之前和期间，缓冲液均放置在冰上。上下翻转溶液直至完全混匀，不能振荡，储存液保存在-20℃条件下并尽量避免反复冻融。

2.用1X缺口平移缓冲液稀释DNA酶储存液，稀释比例为1:500

3.在冰上将下列成分加到小离心管中：1μL模板DNA、2.5μL 10X缺口平移缓冲液、3〜5μL稀释的DNA酶I，加水至25μL。

4.将上述小离心管置37℃温育、10min。

5.将小离心管放在冰上终止反应。

6.在上述反应物中加入1/4体积的10mmol/L乙酸铵和2.5倍体积的无水乙醇进行沉淀。

7.用适当体积的标记溶液重悬沉淀。

8.取部分DNA溶液在1%的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA大小是否合适

2标记

2.1KREATECH推荐的操作程序

当ULS试剂与核酸以1:1比例（如IUULS试剂：1μgDNA)混合，可获得合适的标记效率。当标记的核酸量不是标准的1μg时，核酸与ULS试剂的比例必须保证1:1。当标记的核酸量少时，应该至少100ng、20μL体积。另外，标记较大的核酸量，不应超过20μL中10μg核酸。只有模板浓度不低于5ng/μL可以用较大体积进行标记，ULS试剂量随着加入的模板量进行调整。如果模板稀释度太大，可以不加标记溶液。

1.在1μg模板中加入1U(2μL）ULS试剂。

2.用标记溶液将体积调至20μL，混匀。

3.在65℃条件下温育15min。

4.稍离心。

5.用离心柱纯化探针。

2.2Molecular Probes公司推荐的操作程序

Molecular Probes公司提供应用ULS标记系统结合各种染料的试剂盒。该试剂盒包括破碎DNA和标记探针所用的各种试剂。除了以下几项外，标记操作程序和注意事项基本相同。

1.在标记前，Molecular Probes的ULS染料试剂依据选择的染料溶于不同的缓冲液中。有一个图表提供了与各个染料相关的所有特定信息。

2.标记前，DNA在95℃变性5min，然后在冰上快速冷却。请注意：变性不是必需的步骤，但可以提高标记效率20%〜40%。

3.标记反应物体积是25μL。

4.在80℃温育15min。

5.MolecularProbes声明：由于该公司ULS试剂结合的自有染料的特异性，对以前Kreatech提供的操作步骤已经做了修改

1.超声破碎时，样品体积、装样品的容器种类、超声破碎的时间和循环数、超声破碎仪功率水平和工作循环均依据超声破碎仪生产厂家、型号和探针而不同。为获得大小合适的核酸片段有时需要进行一些预实验。

2.进行DNA酶I消化时，所有的试剂均应放在冰上。用前临时配制溶液。

3.DNA在标记前应进行纯化，去除蛋白质、RNA和游离核苷酸。

4.应尽量避免高浓度Tris(>40mmol/L)或EDTA(﹥5mmol/L)、乙酸镁（>100mmol/L)、NaCl(>100mmol/L)和限制性内切核酸酶消化缓冲液，因为这些对标记反应有限速效应。